生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)
定 價：13 元
- 作者：邵雪玲，毛歆，郭一清
- 出版時間：2003/10/1
- ISBN：9787307039698
- 出 版 社：武漢大學(xué)出版社
- 中圖法分類：Q5-33
- 頁碼：230
- 紙張：膠版紙
- 版次：1
- 開本：16K
本教材按162學(xué)時編寫，總共分為七大部分，實驗分上下學(xué)期完成，本學(xué)期完成生物化學(xué)部分，下學(xué)期完成分子生物學(xué)部分。希望通過本教材的指導(dǎo)，同學(xué)們能夠順利完成分子生物學(xué)部然。希望通過本教材的指導(dǎo)，同學(xué)們能夠順利完成生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗，并了解現(xiàn)代生物學(xué)與分子生物學(xué)實驗最基本的技術(shù)。并在今后專業(yè)課程的學(xué)習(xí)和將來的工作中能靈活應(yīng)用。本教材所涉及的技術(shù)面比較廣泛�？晒├砜�、農(nóng)林類及醫(yī)學(xué)各科學(xué)生參考使用。
隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)的迅速發(fā)展，生命科學(xué)在理論與應(yīng)用上都取得了驚人的進展。生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)逐漸系統(tǒng)化，現(xiàn)已成為生命學(xué)科各領(lǐng)域研究的常規(guī)技術(shù)。為了培養(yǎng)創(chuàng)新人才，與世界接軌，我們在實驗教學(xué)中進行了大量的改革：根據(jù)實驗室條件，盡可能刪除一些落后的實驗方法，引進現(xiàn)代的實驗方法，在原有實驗教材的基礎(chǔ)上，減去了部分驗證性實驗，加強了生物化學(xué)技術(shù)訓(xùn)練的實驗，其內(nèi)容包括了生物物質(zhì)的定量測定技術(shù)、電泳技術(shù)、層析技術(shù)、大分子物質(zhì)的提取及離心技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、酶活性測定及動力學(xué)分析、質(zhì)粒DNA的提取、酶切、鑒定；PCR技術(shù)；感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)；DNA重組及表達等。
本教材按162學(xué)時編寫，總共分為七大部分，實驗分上下學(xué)期完成，上學(xué)期完成生物化學(xué)部分，下學(xué)期完成分子生物學(xué)部分。希望通過本教材的指導(dǎo)，同學(xué)們能夠順利完成生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗，并了解現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗最基本的技術(shù)，并在今后專業(yè)課的學(xué)習(xí)和將來的工作中能靈活應(yīng)用。本教材所涉及的技術(shù)面比較廣泛，可供理科、農(nóng)林類及醫(yī)學(xué)各科學(xué)生參考使用。
盡管我們用最大努力來編寫本教材，但由于編寫本教材的時間緊，有錯誤的地方是在所難免的，希望同學(xué)們在使用的過程中提出意見，以便更好地完善教材。使用本教材的同時，同學(xué)們還應(yīng)參看其他教材或文獻，拓寬自己的視野，這樣才能寫出較好的實驗報告。
本教材第一部分、第二部分、第六部分及第七部分由邵雪玲編寫；第三部分、第四部分由郭一清編寫；第五部分由毛歆編寫。參加教學(xué)改革實驗的還有楊惠、沈小玲。感謝武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教學(xué)辦、武漢大學(xué)教務(wù)部及武漢大學(xué)出版社對本教材出版的支持。
編者
2003．6．6
第一部分 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗放門
一、實驗室規(guī)則
（一）實驗室安全規(guī)則
（二）實驗室衛(wèi)生規(guī)則
（三）學(xué)生守則
二、常用儀器的使用方法
（一）722型分光光度計
（二）752型紫外可見分光光度計
（三）離心機
（四）微量移液器
（五）電子天平
（六）Elx酶標(biāo)儀
（七）Pct-100pcr儀
三、器皿的洗 滌及要求
（一）一般實驗要求
（二）分子生物學(xué)實驗要求
四、實驗結(jié)果的記錄及保存
五、實驗報告的完成
六、實驗成績評分方法
第二部分 生物大分子的制備及鑒定實驗
實驗一 蛋白質(zhì)的鹽析分極分離及凝膠層析脫鹽
實驗二 凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)的分子量
實驗三 醋酸橇維素膜電泳分離鑒定蛋白質(zhì)
實驗四 蛋白質(zhì)含量的測定
實驗五 瓊脂糖凝膠電泳分離乳酸脫膠電泳
實驗六 常規(guī)蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳
實驗七 蛋白質(zhì)的雙向電泳
實驗八 丹磺�；ǚ治龅鞍椎癗-末端氨基酸
實驗九 動物基因縛DNA的分離純化
實驗十 核酸的定量測定
實驗十一 SNA 的Tm值測定
實驗十二 植物總TMA的提取
實驗十三 甲醛變性凝膠電泳的鑒定RMA
實驗十四 離子交換柱層析分離核苷酸
第三部分 酶動力學(xué)測定實驗
實驗一 酵母蔗糖的制備
實驗二 DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
實驗三 各級分蔗糖酶活性測定及純化率的計算
實驗四 底物濃度對催化反應(yīng)速度的影響及米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax的測定
實驗五 反應(yīng)時間對產(chǎn)物形成的影響
實驗六 pH值、溫度、抑制劑對蔗糖酶活性的影響
第四部分 免疫化學(xué)檢測實驗
實驗一 免疫血清的制備
實驗二 雙向免疫擴散法測定抗血清效價
……
第五部分 分子生物學(xué)實驗
第六部分 開放及綜合設(shè)計性實驗
附錄
2．蛋白質(zhì)N末端氨基酸的DNS化
取0．5mg蛋白質(zhì)樣品，置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后，加入0．5m10．2mol/L碳酸氫鈉溶液。再加入0．5mlDNS-CI丙酮溶液，用三乙胺調(diào)至pH9，0-9，5，塞好塞子，于40℃烘箱中反應(yīng)2h，或室溫(25℃左右)放置2—4h，生成DNS-蛋白質(zhì)。
3．DNS蛋白質(zhì)的水解
DNS化反應(yīng)結(jié)束后。真空蒸去丙酮，加入0．5ml 6mol幾鹽酸溶解DNS-蛋白質(zhì)。全部移入水解管。抽真空封管，于111℃烘箱中水解18-24h。開管后蒸去鹽酸，加少量水，再蒸干。重復(fù)2—3次以除盡鹽酸。
4．DNS一氨基酸的抽提
將上述水解產(chǎn)物，加O．5ml水，用1mol幾鹽酸調(diào)至pH2—3加入0．5ml乙酸乙酯抽提，分層可在細長滴管中進行。重復(fù)抽提2—3次，將上層抽提液合并于小試管中，抽去乙酸乙酯，置于干燥器中備用。
5．DNS-氨基酸的層析與檢測
生成的DNS-氨基酸和標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸分別進行聚酰胺薄膜層析。
(1)聚酰胺薄膜的準(zhǔn)備
將聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm的方塊，在距邊0．5cm處畫互為垂直的兩條基線，交叉點為原點。若只做單相層析，則只畫一條基線，在基線上每隔1cm畫一點樣點。
(2)點樣
用毛細管取樣，點在點樣位置上，點樣直徑應(yīng)小于2mm。若多次點樣，則點一次，吹干一次。
(3)展開
將點好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形。樣品則在筒內(nèi)，箍以線圈固定。放在小層析槽內(nèi)(可在小干燥器內(nèi)置一培養(yǎng)皿代替)，槽內(nèi)(培養(yǎng)皿)放人5-10ml展開溶劑工，進行展開，以溶劑前
沿到達距頂端0．5cm左右為止(約20min)。取出膜片，吹干。進行雙向?qū)游鰰r，在第一向?qū)游鐾戤�，完全吹�?有時需晾過夜。才能充分吹干)，將聚酰胺薄膜片轉(zhuǎn)90度，用展開溶劑Ⅱ展開。為了區(qū)分DNS-蘇氨酸或者區(qū)分DNS-天門冬氨酸與DNS-谷氨酸，可在溶劑Ⅱ展開后，吹干，接著用溶劑Ⅲ沿同一個方向展開，只需展開至一半高度即可。為了區(qū)別乞εDNS-賴氨酸、α-DNS-組氨酸與DNS-精氨酸，應(yīng)在溶劑Ⅱ中展開后，吹干，接著在溶劑Ⅳ中沿同一個方向展開。
(4)DNS，氨基酸的檢測
展開結(jié)束后，取出薄膜，用電吹風(fēng)機吹干，在360nn、或280nm的紫外燈下檢測。DNS一氨基酸呈黃色熒光。此外還有其他顏色的雜點，如DNS-OH顯綠色熒光等。用樣品的層析譜與標(biāo)準(zhǔn)DNS一氨基酸層析譜相比較，可鑒別樣品DNS-氨基酸的種類。
【思考】
1．薄膜層析與其他層析法比較有哪些優(yōu)點？
2．選用展層劑的依據(jù)是什么？
實驗九 動物基因組DNA的分離純化
【目的和要求】
掌握鹽溶法大量制備動物基因組DNA的基本原理和方法。
【實驗原理】
根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來，再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出，達到分離提純的目的。
在0．14mol/L的氯化鈉溶液中，RNA核蛋白(RNP)溶解度大，而DNA核蛋白(ODNP)溶解度較��；相反，在lmol/L的氯化鈉溶液中，ONP溶解度最大，而RNP溶解度卻很小，從而使DNA、RNA核蛋白分開。核蛋白分離后可用蛋白變性沉淀劑(氯仿+異戊醇、十二烷基硫酸鈉、熱酚等)去除蛋白質(zhì)，釋放核酸，核酸便從溶液中析出。
動物肝中含有核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶，因此要保持低溫，要防止Mg2+，F(xiàn)e2+及c02+等激活離子。
【實驗器材和試劑】
1．試劑：
(1)sc緩沖液：2．94g檸檬酸鈉和9．0g氯化鈉溶于1L蒸餾水。用鹽酸調(diào) pH至7．0。
(2)5%SDS溶液
(3)95%乙醇、氯仿、異戊醇。
2．器皿
冷凍離心機、組織搗碎機、燒杯、量筒、玻璃棒、三角燒瓶、離心管。
【實驗方法】
新鮮豬肝4g，用$13溶液洗去血液，低溫剪碎后，加入8ml上述溶液，繼續(xù)搗碎，將勻漿物于4000r/min離心10min，上層是RNP提取液，下層是DNP及細胞碎片。將上層傾出(也可留下制備RNA)，下層再用5mlSC溶液重復(fù)抽提兩次，以減少RNP對DNP抽提的影響。
下層沉淀移入三角燒瓶，加同上溶液20ml，混勻，加4m15%SDS混勻。加15ml氯仿/異戊醇(20/1)混合液棍勻，邊搖邊加固體氯化鈉，使其終濃度達：lmol/L，充分振蕩30rain。4000r/in離心20rain，小心取出離心管，觀察有三層，上層為水相(I)NA溶解在此)，中間乳白色為蛋白質(zhì)沉淀層，下層為氯仿層。甩吸管小心吸取上層。同樣方法去蛋白，至中聞層無蛋白沉淀層為止。
量取上層水相體積后，在燒杯中加等體積冷乙醇(95%)，邊鯫邊攪拌(沿一個方向)，玻璃棒上有纖維狀DNA纏繞，當(dāng)DNA全部繞上后，擠干，再用無水乙醇洗一次，取出于干燥器干燥。稱重，計算得率。
……
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