流式細胞術——原理、操作及應用(第二版)主要介紹流式細胞術的原理、操作及應用，分為概述、流式細胞儀的原理、流式圖、流式細胞術的基本操作與技巧、流式分析術的應用和流式分選術的應用6個部分。概述部分介紹基本概念和幾款常見的流式細胞儀；原理部分具體介紹流式細胞儀的液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)和分選系統(tǒng)；流式圖部分主要介紹了流式通道、流式直方圖、流式散點圖和流式等高線圖；操作部分介紹了樣品制備、熒光素偶聯(lián)抗體及標記、光電倍增管電壓設定、對照設置、補償調節(jié)、閾值設定、死細胞問題處理、分選模式選擇、上樣速度控制、分選設門原則、分選基本步驟等內容；流式分析術的應用部分具體介紹了流式細胞術在免疫學方面的應用，并且擴展到基礎醫(yī)學和生物學方面的應用；流式分選術的應用部分闡述了不同條件下流式分選的策略選擇和注意事項，同時還介紹了各種干細胞包括腫瘤干細胞等的流式分選方法。
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深入淺出，通俗易懂；操作的全面性；理論聯(lián)系實踐；加強了流式分選的相關內容。
曹雪濤，中國工程院院士，現(xiàn)任中國醫(yī)學科學院院長、北京協(xié)和醫(yī)學院校長。中國免疫學會理事長，醫(yī)學免疫學國家重點實驗室主任，全軍免疫與基因治療重點實驗室主任，“長江計劃”特聘教授，國家免疫學重點學科帶頭人，國家杰出青年科學基金獲得者，國家973免疫學項目首席科學家，863計劃醫(yī)藥生物技術領域專家，國家自然科學基金免疫學重大項目和創(chuàng)新團隊項目負責人，國務院學位評議委員會學科評議組委員。
目錄
序 i
第二版前言 v
第一版前言 vii
1 概述 1
1.1 流式細胞術基本概念 2
1.2 分析型流式細胞儀介紹 5
1.3 分選型流式細胞儀介紹 9
參考文獻 13
2 流式細胞儀的原理 14
2.1 液流系統(tǒng) 15
2.2 光路系統(tǒng) 18
2.3 檢測分析系統(tǒng) 28
2.4 分選系統(tǒng) 32
參考文獻 37
3 流式圖 39
3.1 流式通道 40
3.2 流式直方圖 41
3.3 流式散點圖 45
3.4 流式等高線圖 48
參考文獻 50
4 流式細胞術的基本操作與技巧 51
4.1 樣品制備 52
4.1.1 獨立細胞樣品制備 52
4.1.2 免疫器官樣品制備 54
4.1.3 實體臟器樣品制備 55
4.2 熒光素偶聯(lián)抗體及其標記方法 56
4.2.1 熒光素 57
4.2.2 熒光素偶聯(lián)抗體 61
4.2.3 樣品封閉 62
4.2.4 熒光素偶聯(lián)抗體標記 64
4.3 光電倍增管電壓設定 66
4.4 對照的設置 71
4.4.1 陰性對照的設置 71
4.4.2 FMO對照 73
4.4.3 陽性對照的設置 74
4.5 補償調節(jié) 75
4.5.1 補償調節(jié)的原理 75
4.5.2 調節(jié)補償?shù)木唧w方法 76
4.5.3 三色和四色分析補償調節(jié)方法 79
4.5.4 影響補償大小的因素 82
4.6 閾值設定 84
4.7 流式分析中的死細胞問題 85
4.7.1 減少樣品中死細胞比例的方法 86
4.7.2 流式分析時區(qū)分死細胞和活細胞的方法 86
4.8 流式分選模式選擇 91
4.8.1 純化模式 92
4.8.2 富集模式 93
4.8.3 單細胞模式 93
4.9 上樣速度控制 94
4.9.1 流式分析速度控制 95
4.9.2 流式分選速度控制 95
4.10 分選設門基本原則 97
4.11 流式分選基本步驟 99
參考文獻 100
5 流式分析術的應用 102
5.1 細胞群比例測定 103
5.2 表型測定 109
5.3 檢測細胞因子 115
5.3.1 胞內染色法檢測細胞因子 116
5.3.2 胞內染色法與ELISA法比較 123
5.3.3 CBA法測定細胞因子 125
5.3.4 CBA法與ELISA法比較 127
5.4 檢測細胞增殖 128
5.4.1 相對計數(shù)法 129
5.4.2 示蹤染料標記法 133
5.4.3 BrdU和EdU摻入法 138
5.4.4 其他方法 141
5.5 檢測細胞凋亡 142
5.5.1 annexin V/PI雙染色法 142
5.5.2 SYTO/PI雙染色法 145
5.5.3 細胞DNA含量分析法檢測細胞凋亡 146
5.5.4 線粒體損傷檢測法 147
5.5.5 活化的caspase-3檢測法 151
5.5.6 熒光素偶聯(lián)的caspase抑制劑(FLICA)標記法 151
5.5.7 甲酰胺誘導ssDNA單抗檢測法 152
5.5.8 TUNEL法 153
5.6 檢測細胞周期 154
5.6.1 非特異性核酸熒光染料標記法 154
5.6.2 特異性細胞周期調節(jié)蛋白檢測法 159
5.7 檢測細胞殺傷能力 160
5.8 檢測細胞吞噬功能 166
5.9 檢測胞內活化的激酶 168
5.10 檢測細胞自噬 169
5.11 檢測基因表達 171
5.11.1 GFP報告基因系統(tǒng) 171
5.11.2 lacZ報告基因系統(tǒng) 172
5.11.3 β-內酰胺酶報告基因系統(tǒng) 173
5.11.4 新型膜結合型報告分子系統(tǒng) 174
5.12 檢測細胞內兩種蛋白質的直接結合 174
5.12.1 熒光共振能量轉移結合流式細胞術檢測兩種蛋白質的直接結合 174
5.12.2 雙分子熒光互補結合流式細胞術檢測兩種蛋白質的直接結合 176
5.13 微生物學中的應用 177
5.13.1 熒光素偶聯(lián)抗體直接檢測法 178
5.13.2 抗體結合人工熒光微球直接檢測法 179
5.13.3 微生物活性流式檢測 179
5.13.4 人工微球熒光免疫試驗檢測抗體 180
5.13.5 熒光原位雜交流式檢測法 181
5.13.6 PCR免疫微珠法 182
5.13.7 原位PCR雜交流式檢測法 182
5.14 檢測鈣相關分子 183
5.14.1 檢測細胞內游離的鈣離子水平 183
5.14.2 檢測鈣蛋白酶活性 184
5.14.3 檢測細胞膜鈣泵活性 186
5.15 表觀遺傳學中的應用 188
5.15.1 ChIP-on-beads法 189
5.15.2 檢測細胞水平組蛋白修飾情況 191
5.16 檢測縫隙連接介導的細胞通訊 191
5.17 檢測細胞內pH值和鈉氫轉運體活性 194
5.17.1 檢測細胞內pH值 194
5.15.2 檢測鈉氫轉運體活性 196
5.18 其他應用 197
5.18.1 檢測活性氧簇 197
5.18.2 檢測細胞內游離的鋅離子水平 198
5.18.3 檢測端粒長度 199
5.18.4 檢測脂筏結合蛋白 201
引文目錄 203
參考文獻 207
6 流式分選術的應用 211
6.1 流式分選與磁性分選 212
6.2 流式分選獨立群體細胞 214
6.3 流式分選非獨立細胞群體 216
6.4 流式分選低比例細胞群體 220
6.4.1 強勢細胞群的輻射影響 220
6.4.2 流式分選結合磁性分選 221
6.4.3 二次分選法 222
6.5 流式分選干細胞 224
6.5.1 流式分選造血干細胞 224
6.5.2 流式分選側群干細胞 229
6.5.3 流式分選間充質干細胞 231
6.5.4 流式分選腫瘤干細胞 232
參考文獻 235
1概述
流式細胞術(flow cytometry)是20世紀60年代后期開始發(fā)展起來的利用流式細胞儀(flow cytometer)快速定量分析細胞群的物理化學特征以及根據(jù)這些物理化學特征精確分選細胞的新技術，主要包括流式分析和流式分選兩部分。流式細胞儀通過接收激光照射液流內細胞后的散射光信號和熒光信號反映細胞的物理化學特征，如細胞的大小、顆粒度和抗原分子的表達情況等。流式細胞儀的出現(xiàn)和流式細胞術的發(fā)展是多學科領域共同發(fā)展的結晶，其中涉及細胞與分子生物學和生物技術、單克隆抗體技術、激光技術、熒光化學、光電子物理、流體力學、計算機技術等。
流式細胞術主要應用于生命科學的基礎研究，尤其是免疫學、細胞生物學和分子生物學。80年代后期開始應用于臨床，應用流式細胞術測定外周血CD4 T細胞的數(shù)量能用于監(jiān)測HIV感染者疾病的進展，開啟了流式細胞術應用于臨床的新紀元。隨后，利用流式分選干細胞過繼回輸用于疾病的治療，進一步拓展了流式細胞術的臨床應用�，F(xiàn)在，流式細胞術還能輔助多種疾病的診斷，尤其是白血病的診斷和分型。
?1.1??流式細胞術基本概念
1. 原理
特定波長的激光束直接照射到高壓驅動的液流內的細胞，產生的光信號被多個接收器接收，一個是在激光束直線方向上接收到的散射光信號(前向角散射)，其他是在激光束垂直方向上接收到的光信號，包括散射光信號(側向角散射)和熒光信號。液流中懸浮的直徑從0.2~150μm的細胞或顆粒能夠使激光束發(fā)生散射，細胞上結合的熒光素被激光激發(fā)后能夠發(fā)射熒光。散射光信號和熒光信號被相應的接收器接收，根據(jù)接收到的信號的強弱波動就能反映出每個細胞的物理化學特征。
2. 流式細胞術的三大要素
流式細胞術有三大要素，分別為流式細胞儀、樣品細胞和熒光染料或者熒光素偶聯(lián)抗體。流式細胞術是在流式細胞儀上操作的，流式細胞儀根據(jù)其功能的不同可以分為分析型流式細胞儀和分選型流式細胞儀，前者只能流式分析，不能分選純化目標細胞，后者能夠同時進行流式分析和流式分選。
流式細胞術檢測的對象是細胞，而且是呈獨立狀態(tài)的懸浮于液體中的細胞，即單細胞懸液。流式細胞術不能直接檢測組織塊中的細胞，要檢測臟器或組織中的細胞，必須先用各種方法將臟器或組織制備成單細胞懸液，然后標記上熒光素偶聯(lián)抗體，才能被流式細胞儀檢測。
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