第一編 概述
第一章 生命大分子物質的制備
生命大分子物質通常是指動物、植物和微生物在進行生長發(fā)育、新陳代謝時，所形成的蛋白質(包括酶)和核酸等有機化合物的總稱。它不僅是一些生物科學工作者研究、探索的主要對象，還與廣大從事化工、醫(yī)學和食品等學科的人員密切相關。在這些方面，特別是科研方面，隨著人類基因組的30億堿基對測序工作的完成，生命科學研究已進入后基因組時代(研究的焦點將從基因的序列轉移到功能方面)。為鑒定大量未知蛋白質(酶)的結構和功能，蛋白質研究也將進入一個空前活躍的時期，因此分離純化和測試分析蛋白質技術顯得十分重要。首先，蛋白質與核酸(包括DNA、rRNA、mRNA和tRNA等)相比，蛋白質的結構(包括一級結構和空間結構)更具有奇妙獨特的復雜性和藝術性。它是由20多個不同性質(或極性)的氨基酸交互排列而成，不但潛在的數量多(約100億個)，而且相互間差異大。而核酸的結構，雖然也有異乎尋常的多樣性，但是，它是由結構相似、理化性質接近的4個堿基交互排列而成的，且有一定規(guī)律可循。相對而言，蛋白質的分離、純化和鑒定有較大的難度和特殊性。而核酸的分離、制備和鑒定則比較容易，有捷徑可走。其次，蛋白質和核酸類物質通常是與自然界存在的諸多不同化合物結合在一起，或者是不同蛋白質、不同核酸自身相互組合在一起出現的，加之它們穩(wěn)定性較差(如離體后的多數酶)、含量相對偏低，使提取分離過程變得更加困難。最后，提取生命物質的材料五花八門、千變萬化，所用的方法通用性較差，尤其是提取分離蛋白質的方法更是如此，這也給制備工作帶來了麻煩和困惑。盡管如此錯綜復雜，卻也不是無軌跡可尋。另外，在實踐中，確實非常需要一定純度或較高純度的生命大分子物質。因此，人們在細心觀察、認真歸納制備這些物質的程序時，也發(fā)現了不少類似操作和共同點，對制備生命大分子物質很有裨益。本章將以蛋白質和核酸為主線討論其制備的共有特質和一般過程，其中包括材料的選擇與處理、測定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(分別見后面各編評述)等相關步驟。
第一節(jié) 材料的選擇與處理
一、材料的選擇在進行材料的選擇時，常會提及有效成分一詞。所謂有效成分是指欲純化的某種單一的生命大分子物質。而有效成分以外的其他物質則統(tǒng)稱雜質。在動物、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少，如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。此外，有效成分穩(wěn)定性較差，大多數對酸、堿、高溫和高濃度有機溶劑等因子較敏感，而且容易被微生物分解變質。因此，提取有效成分的成功與否，與選用的材料關系密切。如果選用的材料不同，有效成分的含量就不一樣；選用的材料即使相同，但是部位、生長期、生長地區(qū)或存放時間不同，有效成分的含量也不盡相同�？偟膩碚f，材料選擇應遵循的原則是：有效成分含量多、穩(wěn)定性好；來源豐富、保持新鮮；提取容易、工藝簡單；雜質有綜合利用價值等。在實踐過程中則需抓主要矛盾，全面考慮，綜合權衡。例如，胰島素，從含量看，在牛胰臟中比豬的高，但從我國實際出發(fā)，全國豬的飼養(yǎng)頭數遠比牛多，加之�？衫�車、耕田，因此制備胰島素一般不選用牛胰臟而選用豬胰臟作材料。磷酸單酯酶，就含量而言，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進行提純時，這兩種酶很難分開，所以實踐中常選用含磷酸單酯酶少、幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。
二、材料的處理
選擇到合適的材料后，應及時使用，否則所需的有效成分會部分甚至全部被破壞變性，從而影響收得率。例如，從豬腸黏膜提取肝素時，如果用新鮮材料，每千克小腸可得肝素鈉5萬～6萬U。如將材料置25℃以上的室溫存放約1h，肝素鈉的含量會顯著下降。其原因是，豬小腸內的大量微生物(2 5×108～3×108個/g)不停地繁殖(如大腸桿菌約20min繁殖一次)，有的會產生降解肝素的酶系。若選擇的材料難于立即使用時，一般應采用冰凍或干燥等方法處理，同時還應將易于去掉的非需物質(如脂類)除去。因常選用的動物、植物和微生物材料的特性各異，故處理要求也不完全相同。
（一） 動物臟器
1 冰凍從剛宰殺的牲畜得到的臟器(腦組織、心臟等)要迅速剝去脂肪和筋皮等結締組織，立即沖洗干凈。若不能馬上抽提、純化時，應及時移至-10℃冰庫(可短時間保存)或-70℃低溫冰箱(數月不變質)貯存。
臟器中常含有較多的脂肪，該物質不僅容易氧化酸敗，導致原料變質，還會影響純化操作和制品得率。脫脂操作可在提純前進行，也可在提純過程中進行，具體實施應視材料而定。一般脫脂的方法有：人工剝去臟器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂；采用快速加熱(50℃左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去；利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。
2 干燥
對于像腦下垂體一類的小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存?zhèn)溆�；對于含耐高溫有效成�?如肝素)的腸黏膜，可在沸水中蒸煮處理，烘干后能長期保存。
（二）植物組織
由室內栽培或野外采集的植物材料，若是植物(如菠菜、芹菜)的葉片，需用清水洗凈方可使用，或置-30～-4℃冰箱貯藏，可在10h內使用；若是植物的種子，則需泡脹或粉碎后才可使用。如材料中含油脂較多時，也要進行脫脂處理。
（三）微生物
由于微生物具有種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡便、誘變容易和不受季節(jié)影響等優(yōu)點，因此，它已成為制備生命大分子物質的主要材料之一。當選用的微生物接種于適當的培養(yǎng)液培養(yǎng)一段時間后，用離心法收集到的上清液，即可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分。而收集到的菌體，經破細胞處理后則可從中提取其他有效成分，如胞內酶。前者可置低溫下短時間貯存，后者可制成凍干粉，在4℃保存。例如，收集的黃桿菌(Flavobacterium sp.)P32細胞，用0 05mol/L TrisHCl緩沖液(pH7 5)洗兩次，進行凍干處理可得到紅棕色的干粉。將其置4℃保存3個月，檢測降解對硫磷水解酶活力的影響時，發(fā)現無明顯影響。
第二節(jié) 測定方法的確立
一、目的與要求當純化的對象即某一有效成分選定后，首先碰到的問題是，此物質在哪些材料中含有？哪些材料中含量較豐富？其次是在從選定的材料提純此物質的過程中，雜質是否逐漸減少？純度是否逐漸增加？也就是說，所用的純化方案是基本合理或部分合理，還是根本不妥？要回答這些問題，就必須確立一種專一、靈敏和簡便快速的測定方法。不然，很難對其作出準確、定量的判斷。
第一節(jié)提到，有效成分在原材料中含量較低。這一事實決定了抽提液和純化的前一階段溶液中有效成分的比活性較小，加之此時測定的樣品很多(每一步驟都須測定)，因而確立的測定方法應簡單、靈敏、省時、快速，除此之外，還要有較好的專一性，否則，所測得的結果誤差大，不可靠。例如，在從原料中純化某一酶蛋白時，測定其含量的依據常常是在酶與底物反應后，以產物形成或底物降低的數量來表示的。若選擇的底物是非專一性的，或者選擇的產物不是待測酶特異催化形成的，這樣測出的數值就包含有原料中雜質所消耗的底物或形成的產物，影響了酶活性的真實性。
二、常用的測定方法
（一）光譜法由于不同生命大分子物質與相應波長的光會發(fā)生特定的作用，而依據作用結果即可推斷出被測物質的含量和部分理化性質。人們稱這類測定方法為光譜法。該法通常包括紫外光譜法、可見光光譜法、熒光光譜法和濁度法等。紫外光譜法是利用某些生物大分子物質具有吸收紫外線的性質而建立的一種方法；可見光光譜法是利用生命大分子物質的一些特殊結構先與相關試劑反應生成不同顏色后，借助可見光檢測物質而建立的一種方法；熒光光譜法是利用有些生命大分子物質自身可以吸收特定光波的能量后，依賴發(fā)出熒光的特性而建立的一種方法；濁度法是利用測定不同濃度的稀懸浮液，在不被吸收的光波長條件下，測定其表觀吸光值而建立的一種方法。
將待測物(如核酸、蛋白質)配制成一定濃度的溶液后，注入石英杯，移至相應波長的分光光度計中，即可從測定的吸光值換算出待測物的含量。
1 紫外光譜法
1）測定核酸含量構成核酸的堿基組分是分光光度計測定核酸含量的依據。在波長260nm測定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增高或降低，會使其吸光值(A260)隨之發(fā)生增高或降低變化，二者之間呈正比關系。通常1個A260分別相當于50μg/ml雙鏈DNA、37μg/ml單鏈DNA和40μg/ml單鏈RNA。另外，用A260/A280可確定DNA和RNA的純度(純DNA和純RNA的比值分別為1 8和2 0)，當此比值分別小于1 8和2 0時，表明樣品中已污染了蛋白質或酚類等物質。
2）測定蛋白質的含量及純度蛋白質(包括酶和肽)溶液的A280主要是由構成蛋白質組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的吸光值決定的，胱氨酸(Cys)的貢獻很小。大腸桿菌RNA聚合酶σ32因子及其Tyr、Trp和Cys的摩爾吸光系數和氨基酸含量見表11。
由表11中數據可見，其摩爾吸光系數與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的很相似。所謂摩爾吸光系數是指某物（如BSA）在1mol/L 濃度時，置特定波長（如280nm）下測定出的吸光值，對一個純物質來說，該值在特定條件下應該是個恒定值。同樣百分吸光系數(某物在1%濃度時，特定條件下所測定的吸光值)無疑也是個恒定值。不同物質因結構的差異性或Tyr、Trp等氨基酸含量的不同，測出的吸光系數也各不相同。
2 可見光光譜法
將待測物(如蛋白質、核酸、糖類)與相關試劑(表12)或酶的底物作用后，注入玻璃杯，根據呈現的顏色或形成的產物特性，移至相應波長的分光光度計中，即可從測定的吸光值換算出待測物的含量。例如，鄰苯二酚(275nm有吸收峰)在鄰苯二酚2，3雙加氧酶的作用下，可轉化為黃色的α羥基粘康酸半醛(375nm有吸收峰)，通過檢測375nm吸光值的升高，即可換算出所用酶的活性單位。
另外，還可用不同吸光值之間的比值鑒定某些物質的純度。例如，純細胞色素c還原型A550/氧化型A280為1 25～1 28。假如比值過高或過低，就表明細胞色素c被污染。
3 熒光光譜法
熒光光譜法的精確性、重復性和靈敏度比吸收光譜法好。當分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測時， 改用熒光光譜法卻能求得滿意結果。例如，NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的連鎖反應是由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光，因此它們可用于偶聯NADH2(或NADPH2)的氧化或 NAD(或NADP) 的還原反應系統(tǒng)進行熒光測定。通常谷草轉氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT)活性測定，是采用與蘋果酸脫氫酶(malicdehydrogenase，MDH)相偶聯反應進行：
4 濁度法
通過測定某物質的表觀吸光值，即可求出其含量。例如，伴刀豆球蛋白(concanavalin，Con A)的活性測定方法之一就是采用此法完成的。即將一定濃度的Con A 溶液與糖原反應后，可產生相應濁度且無沉淀的懸浮液，測定420nm波長下的吸光值(A420)，即能求出Con A的活性或濃度，此法也可用于分析培養(yǎng)液中細菌（如E. coli）生長的狀況，即定時取樣，檢測其波長600nm的表觀吸光值(A600)，即可求出相關細菌的濃度。
（二）電化學法
有些化學反應過程放出質子氫(H+)，可用靈敏的pH計或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計算出欲測物的含量或活性。例如，葡糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡糖氧化酶的活性。一種細菌No 66的脫氯酶能催化單氯乙酸和(或)二氯乙酸釋放出Cl-，使所處溶液的pH降低。這些Cl-的濃度，可用氯離子選擇電極和雙液參比電極進行測定。
（三）生物活性檢測法
大多數生命物質，尤其是一些激素類物質，當把它們注射入動物的特定器官時，所屬機體將發(fā)生相應的變化，并且二者間有一定的相關性。根據這一性質設計的方法，即可對生命活性物質進行檢測。例如，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)能使小鼠子宮加速增殖，因此通過檢