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郭江峰編著的《基因工程(生物工程專業(yè)綜合素質(zhì)培養(yǎng)型系列教材)》系統(tǒng)介紹了基因工程的原理、策略、技術(shù)方法和應(yīng)用等方面的內(nèi)容，具有較強(qiáng)的前瞻性和實(shí)用性。全書分為基因工程基礎(chǔ)、基因工程操作方法和基因工程應(yīng)用技術(shù)3篇，共13章，內(nèi)容包括基因工程的概況、核酸操作技術(shù)、工具酶、載體與宿主系統(tǒng)、DNA 的克隆策略、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA序列分析、重組子的篩選、目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)、目的蛋白的純化與分析、基因操作技術(shù)在醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用、轉(zhuǎn) 基因生物和基因工程的安全性與發(fā)展前景。《基因工程(生物工程專業(yè)綜合素質(zhì)培養(yǎng)型系列教材)》可作為高等院校生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、生物制藥等相關(guān)專業(yè)本科生的教學(xué)用書，也可供相關(guān)的科研、技術(shù)和管理人員參考。

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第一篇基因工程基礎(chǔ)
第一章基因工程概況
第一節(jié) 基因與基因工程
一、基因的概念
1.基因概念的提出與發(fā)展
基因概念的提出已有100 多年的歷史，在這期間我們逐漸認(rèn)識(shí)、深化了這個(gè)概念。
遺傳學(xué)奠基人Mendel 于1865 年2 月在奧地利自然科學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)議上報(bào)告了自己植物雜交試驗(yàn)的研究結(jié)果，次年在該學(xué)會(huì)期刊上發(fā)表了著名的《植物雜交試驗(yàn)》的論文。文中指出，生物的每一個(gè)性狀都是通過(guò)遺傳因子來(lái)傳遞的，遺傳因子是獨(dú)立的遺傳單位。這樣就把可觀察的遺傳性狀和控制其內(nèi)在的遺傳因子區(qū)分開來(lái)，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。
1909 年，丹麥遺傳學(xué)家Johansen 首先提出“基因（gene）” 的概念，它不包含特殊的物質(zhì)基礎(chǔ)，只是用來(lái)描述傳遞和表達(dá)特定的生物性狀的可遺傳因子，以此替代孟德爾假定的“遺傳因子” 。
1911 年， Morgan 指出基因定位于染色體上，建立了著名的基因?qū)W說(shuō)，還繪制了果蠅的基因位置圖，首次完成當(dāng)時(shí)最新的基因概念的描述，即基因以直線形式排列，它決定著某一特定的性狀，而且能發(fā)生突變，并隨著染色體同源節(jié)段的互換而交換。它不僅是決定性狀的功能單位，而且是一個(gè)突變單位和交換單位。
20 世紀(jì)40 年代末至50 年代初，基因的化學(xué)本質(zhì)被證實(shí)。1944 年， Avery 及其同事MacLeod 和McCarty 在肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化研究中，首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA 是遺傳信息的載體。1952 年， Hershey 和Chase 用放射性同位素標(biāo)記噬菌體注入細(xì)菌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA 而不是蛋白質(zhì)。
1953 年，美國(guó)分子生物學(xué)家Watson 和英國(guó)分子生物學(xué)家Crick 根據(jù)X 射線衍射分析，提出了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，進(jìn)一步說(shuō)明基因的成分就是DNA ，它控制著蛋白質(zhì)合成。在基因位于染色體上，并且能用重組方法作圖定位的概念建立后，人們逐漸認(rèn)識(shí)到單個(gè)基因是遺傳信息結(jié)構(gòu)和功能的基本且不可分割的單位；從結(jié)構(gòu)和功能來(lái)看，它們以線性的形式相互連接（串珠理論， the beads on a string theory）。
1957 年，法國(guó)遺傳學(xué)家Benzer 以T4 噬菌體作為研究材料，分析了基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)打破了過(guò)去關(guān)于基因是突變、重組、決定遺傳性狀的“三位一體” 概念及基因是最小的不可分割的遺傳單位的觀點(diǎn)。Benzer 認(rèn)為順?lè)醋訛榛蚬δ懿豢煞指畹膯挝弧Ｄ墚a(chǎn)生一種多肽的是一個(gè)順?lè)醋樱?順?lè)醋右簿褪腔虻耐x詞。但一個(gè)順?lè)醋涌梢园幌盗型蛔儐挝弧蛔冏印Ｍ蛔冏邮荄NA 中構(gòu)成基因的一個(gè)或若干個(gè)核苷酸。由于基因內(nèi)的各個(gè)突變子之間有一定距離，所以彼此間能發(fā)生重組，重組頻率與突變子之間的距離成正比，距離近，重組頻率低；距離遠(yuǎn)，重組頻率就高。順?lè)醋痈拍畎鸦蚓唧w化為DNA 分子的一段序列，它負(fù)責(zé)遺傳信息傳遞，是決定一條多肽鏈的完整性的功能單位；但它又是可分的，組成順?lè)醋拥暮塑账峥梢元?dú)自發(fā)生突變或重組，而且基因與基因之間還有相互作用�；蚺帕械奈恢貌煌瑫�(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)。
1961 年，法國(guó)科學(xué)家Jacob 和Monod 在研究大腸桿菌乳糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)有些基因不起蛋白質(zhì)合成模板的作用，只起調(diào)節(jié)或操縱作用，提出了操縱子學(xué)說(shuō)。從此，根據(jù)基因功能把基因分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和操縱基因。
2.基因的現(xiàn)代概念
20 世紀(jì)70 年代以后，隨著分子生物學(xué)研究的深入，人們能夠在分子水平上認(rèn)識(shí)基因的結(jié)構(gòu)與功能，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了移動(dòng)基因、斷裂基因、重疊基因及假基因等，對(duì)基因的認(rèn)識(shí)有了進(jìn)一步深化。
（1）移動(dòng)基因（movable gene）
1951 年，美國(guó)遺傳學(xué)家McClintock 提出了可移動(dòng)的遺傳基因?qū)W說(shuō)，即跳躍基因（jumping gene）。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為基因可從染色體的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置，甚至從一條染色體跳躍到另一條染色體上，為研究遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控、生物進(jìn)化與癌變提供了線索。
（2）斷裂基因（spliting gene）
斷裂基因最初是Roberts 和Sharp 在腺病毒研究中發(fā)現(xiàn)的（圖1-1）。過(guò)去人們認(rèn)為，基因的遺傳密碼子連續(xù)不斷地排列在一起，形成一條沒(méi)有間隔的完整的基因?qū)嶓w。事實(shí)上，一個(gè)基因可分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段，我們稱這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因?yàn)閿嗔鸦�。根�?jù)當(dāng)前的研究，所有哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物和高等植物以及簡(jiǎn)單的真核生物（如酵母），甚至少數(shù)原核生物中都存在斷裂基因。
（3）重疊基因（overlapping gene）
傳統(tǒng)的基因概念把基因看成是互不重疊、單個(gè)分離的實(shí)體。在人們的觀念中，一直認(rèn)為同一段DNA 序列內(nèi)不存在重疊的讀碼結(jié)構(gòu)。1973 年，哈佛大學(xué)的Weiner 等在研究感染大腸桿菌的Qβ病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)基因在編碼生成蛋白質(zhì)時(shí)是從同一起始點(diǎn)開始的。1977 年， Sanger等測(cè)定了噬菌體ΦX174 DNA 全序列的5735 （現(xiàn)為5737 ）個(gè)核苷酸，最多能編碼1795 個(gè)氨基酸，所合成的全部蛋白質(zhì)的總相對(duì)分子質(zhì)量最多為197 000 （以每個(gè)氨基酸平均相對(duì)分子質(zhì)量為110 計(jì)算），可實(shí)際測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量卻是262 000 。這是因?yàn)椴煌虻暮塑账嵝蛄杏袝r(shí)是可以共用的，同一段DNA 能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子（圖1-2），我們稱這樣的兩個(gè)基因?yàn)橹丿B基因。
（4）假基因（pseudogene）
1977 年， Jacq 等根據(jù)對(duì)非洲爪蟾5S rRNA 基因簇的研究，首次提出假基因的概念，該基因的5′端有16bp 的缺失以及另外14bp 的錯(cuò)配。隨著大量不同家族的假基因的發(fā)現(xiàn)，假基因被明確限定為與功能基因相關(guān)的、有缺陷的核苷酸序列。假基因一度由于與正�；虼嬖诮Y(jié)構(gòu)上的差異，或不能轉(zhuǎn)錄或翻譯，或產(chǎn)生有缺陷的蛋白質(zhì)而失去原有功能，被認(rèn)為是“死亡基因” 。隨著對(duì)非表達(dá)序列的深入研究，假基因的重要性比我們想象的要大，有的對(duì)生存至關(guān)重要。
隨著生命科學(xué)日新月異的發(fā)展，更多新的基因存在形式不斷被發(fā)現(xiàn)，基因的內(nèi)涵也在不斷發(fā)生變化，我們對(duì)基因的理解也在不斷地發(fā)展和深化。但基因的本質(zhì)仍然是遺傳信息的結(jié)構(gòu)與功能單位，有人用基因就是一套與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的順式遺傳指令來(lái)概括基因的概念。這類順式遺傳指令可以轉(zhuǎn)錄，也可以不轉(zhuǎn)錄；在DNA 結(jié)構(gòu)上可連續(xù)，也可不連續(xù)；轉(zhuǎn)錄本可以是一種，也可以是幾種（表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄的起始、終止或剪輯的差異上）；翻譯后的加工也會(huì)造成產(chǎn)物的多樣性，強(qiáng)調(diào)了基因編碼產(chǎn)物形式的多樣性。基因有如此多的內(nèi)涵和形態(tài)，與生命的進(jìn)化和滿足不同生理活動(dòng)的需要是分不開的。
二、基因工程的概念
基因工程（gene engineering）是以遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，引入工程學(xué)的一些概念，通過(guò)周密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行精確的實(shí)驗(yàn)操作，在體外通過(guò)人工“剪切” 和“拼接” 等方法將核酸分子進(jìn)行改造，然后插入病毒、質(zhì)�；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入原先不含有該分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，而且能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖，高效率地達(dá)到預(yù)期目的。
基因工程在理論上可自成體系，稱為基因工程學(xué)，從方法上又是一門成熟、應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，正是由于其雙重性，相關(guān)術(shù)語(yǔ)很繁雜，未很好地統(tǒng)一，在文獻(xiàn)中常見的有遺傳工程（genetic engineering ）、基因工程（gene engineering ）、基因操作（genemanipulation）、重組DNA 技術(shù)（recombinant DNA technology ）以及基因克�。╣ene cloning）、分子克�。╩olecular cloning ）等。這些術(shù)語(yǔ)所代表的具體內(nèi)容都是彼此相關(guān)的，在許多場(chǎng)合下被混用，很難嚴(yán)格區(qū)分。從某種意義上講，它們之間的差別，僅僅是各自考慮的角度和強(qiáng)調(diào)的側(cè)重點(diǎn)不同。
在英語(yǔ)中“clone （克�。� 一詞當(dāng)名詞使用時(shí)，是指從一個(gè)共同祖先經(jīng)無(wú)性繁殖得到的一群遺傳上同一的DNA 分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體；而當(dāng)“clone” 作動(dòng)詞使用時(shí)，則是指從同一個(gè)祖先產(chǎn)生這類同一的DNA 分子群體、細(xì)胞群體或個(gè)體群體的過(guò)程。所以要注意在不同的場(chǎng)合，克隆一詞有不同的含義。在體外重新組合DNA 分子的過(guò)程中，是通過(guò)能夠獨(dú)立自主復(fù)制的載體分子質(zhì)粒或噬菌體為媒介，將外源DNA 引入宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從而為遺傳上同一的生物品系（它們都帶有同樣的重組DNA 分子）成批地繁殖和生長(zhǎng)提供了有效的途徑。故此，習(xí)慣上也把基因工程稱為基因克隆或DNA 分子克隆。
在中文文獻(xiàn)中，曾將“DNA cloning” 直接譯為DNA 純系繁殖，實(shí)質(zhì)上它是特指利用微生物制備大量純一的特定DNA 片段的一種方法。由于運(yùn)用重組DNA 技術(shù)能夠按照人們預(yù)先的設(shè)計(jì)創(chuàng)造出許多新的遺傳結(jié)合體、具有新奇遺傳性狀的新型生物，因此有時(shí)人們又把基因工程籠統(tǒng)地稱為遺傳工程或遺傳操作。其實(shí)這種將“遺傳工程” 和“基因工程” 兩個(gè)術(shù)語(yǔ)不加區(qū)分地使用，甚至認(rèn)為兩者完全等同的認(rèn)識(shí)是不準(zhǔn)確的。嚴(yán)格地說(shuō)，遺傳工程是指以改變生物有機(jī)體性狀特征為目標(biāo)的遺傳信息的操作（the manipulation of the information content ），它既包括常規(guī)的選擇育種，也包括相對(duì)復(fù)雜的基因克隆等不同的技術(shù)層次。因此，遺傳工程雖然包括了基因工程的內(nèi)容，但它所涉及的內(nèi)容卻比基因工程要廣泛得多，兩者之間是有差別的。
三、基因工程的操作流程
基因工程的主要步驟為：切— 接— 轉(zhuǎn)— 選— 表達(dá)（圖1-3），具體操作流程如下。
（1）分離或合成基因（isolation or synthesis of gene）
從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR 擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA 片段，這種DNA 片段被稱為“目的基因” 。
（2）體外重組（recombination of DNA in v itro）
在體外，將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA 分子。
（3）外源DNA 導(dǎo)入細(xì)胞中（introduction of foreign DNA into cell）
將重組DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。
（4）篩選（selection of recombinant DNA ）
從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA 分子的受體細(xì)胞克隆。目的基因的導(dǎo)入過(guò)程是肉眼看不到的，因此，要知道導(dǎo)入是否成功，應(yīng)事先找到特定的標(biāo)志。例如，我們用一種經(jīng)過(guò)改造的抗四環(huán)素質(zhì)粒pSC100 作載體將一種基因轉(zhuǎn)入自身無(wú)抗性的大腸桿菌時(shí)，如果基因轉(zhuǎn)入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說(shuō)明轉(zhuǎn)入獲得成功。
（5）鑒定（identification and analysis of cloned gene）
從篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆中提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。
（6）表達(dá)（expression of cloned gene）
將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入高效、穩(wěn)定的具有功能性表達(dá)能力的基因工程細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的目標(biāo)產(chǎn)物。
（7）分離表達(dá)產(chǎn)物（isolation of product）
利用工程技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)上述基因工程細(xì)胞，獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物并分離、純化，獲得所需的基因工程產(chǎn)品。
上述步驟可歸并為兩大部分，分屬上游技術(shù)（步驟1～5 ）和下游技術(shù)（步驟6 、7）。上游技術(shù)具有一定的共性，下游技術(shù)具有較強(qiáng)的個(gè)性，兩大部分有機(jī)結(jié)合成為一個(gè)整體。上游技術(shù)是基因克隆的核心與基礎(chǔ)，但必須與下游技術(shù)密切聯(lián)系才有生命力，所以上游設(shè)計(jì)中應(yīng)以簡(jiǎn)化下游工藝和裝備為指導(dǎo)思想。下游技術(shù)必須依賴上游技術(shù)才能不斷開拓、發(fā)展、壯大，下游技術(shù)是上游基因克隆藍(lán)圖的體現(xiàn)和保證，是克隆基因產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，兩者必須兼顧。我國(guó)在上游技術(shù)方面與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較小，下游技術(shù)方面差距較大。加強(qiáng)下游技術(shù)的創(chuàng)新研究是今后努力的方向。
四、人類基因組計(jì)劃
1.人類基因組計(jì)劃（human genome project ， HGP）
對(duì)基因組核苷酸全序列的測(cè)定與分析，是重組DNA 技術(shù)促進(jìn)基礎(chǔ)生物學(xué)研究的出色范例。英國(guó)分子生物學(xué)家Sanger 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，于1977 年首先完成了全長(zhǎng)5387bp 的ΦX174 噬菌體基因組全序列測(cè)定工作，揭開了大規(guī)�；蚪M測(cè)序工作的序幕。日本科學(xué)家先后于1987 年完成了全長(zhǎng)155 844bp 的煙草葉綠體基因組全序列的測(cè)定， 1988 年完成了全長(zhǎng)121 024bp 的地錢葉綠體基因組全序列的測(cè)定， 1989 年又完成了全長(zhǎng)134 525bp 的水稻葉綠體基因組全序列的測(cè)定。然而這些細(xì)胞器的基因組無(wú)論在大小還是在復(fù)雜性方面，都是無(wú)法同人類基因組相比擬的。
1985 年，美國(guó)科學(xué)家首先提出了研究人類基因組的設(shè)想。在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)4 年的調(diào)查和論證的基礎(chǔ)上， 1988 年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)了人類基因組作圖和測(cè)序計(jì)劃。同年9 月，DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)者之一Watson 在眾望所歸之下，接受了美國(guó)衛(wèi)生研究院的邀請(qǐng)，出任人類基因組計(jì)劃的負(fù)責(zé)人，開始了令全世界矚目的基因組研究。該計(jì)劃旨在闡明人類基因組30 億個(gè)堿基對(duì)的序列，發(fā)現(xiàn)所有的人類基因，并明確其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我。該項(xiàng)被新聞界喻為“基因圣戰(zhàn)” 的、規(guī)�？涨暗目蒲杏�(jì)劃總投資達(dá)30 億美元。
由于人類基因組計(jì)劃具有的重要意義和深遠(yuǎn)影響，其一經(jīng)提出，便立即引起許多國(guó)家科技界與政府機(jī)構(gòu)的高度重視和強(qiáng)烈反響。特別是西歐和日本等一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國(guó)家，紛紛表示要獨(dú)立開展或參與國(guó)際合作研究。著名的遺傳學(xué)家談家楨教授等人也積極倡議中國(guó)迅速參與人類基因組的國(guó)際合作研究。美國(guó)于1990 年正式啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃后，德國(guó)、日本、英國(guó)、法國(guó)、中國(guó)5 個(gè)國(guó)家的科學(xué)家先后正式加入，中國(guó)的人類基因組計(jì)劃是于1994 年初在吳旻院士、強(qiáng)伯勤院士、陳竺院士和楊煥明教授的倡導(dǎo)下啟動(dòng)的， 1999 年9 月正式加入該計(jì)劃，承擔(dān)了1% 的人類基因組（約3000 萬(wàn)bp）的測(cè)序任務(wù)，是參與該計(jì)劃唯一的發(fā)展中國(guó)家。有科學(xué)家認(rèn)為，人類基因組計(jì)劃是與曼哈頓原子計(jì)劃、阿波羅登月計(jì)劃并列的人類科學(xué)史上的重大工程，是一項(xiàng)改變世界、影響到每一個(gè)人的科學(xué)計(jì)劃。
人類基因組計(jì)劃的科學(xué)宗旨與“定時(shí)、定量、定質(zhì)” 的具體目標(biāo)，是測(cè)定組成人類基因組的上億個(gè)核苷酸的序列，從而闡明人類基因組及所有基因的結(jié)構(gòu)與功能、解讀人類的全部遺傳信息、揭開人體奧秘的基礎(chǔ)，將把人類帶入基因醫(yī)學(xué)的新時(shí)代。生命物質(zhì)的一致性與生物進(jìn)化的連續(xù)性以及人類基因組計(jì)劃所建立的策略與技術(shù)的通用性，意味著人類基因組計(jì)劃可以奠定揭開生命最終奧秘的基礎(chǔ)，由此帶動(dòng)生物信息學(xué)等一批相關(guān)學(xué)科的形成和發(fā)展，促進(jìn)學(xué)科交叉與重組，其帶來(lái)的潛在經(jīng)濟(jì)效益也是驚人的。
2003 年4 月，美國(guó)人類基因組研究項(xiàng)目首席科學(xué)家Collins 博士在華盛頓隆重宣布，美國(guó)、英國(guó)、日本、法國(guó)、德國(guó)和中國(guó)科學(xué)家經(jīng)過(guò)13 年努力共同繪制完成了人類基因組序列圖，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)，標(biāo)志人類基因組計(jì)劃勝利完成。
2.基因組學(xué)（genomics）
1920 年，德國(guó)漢堡大學(xué)教授Hans Winkler 首次使用基因組（genome）這一名詞。一個(gè)生物體的基因組是指整套染色體所含有的完整的DNA 序列，包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA 序列�；蚪M一詞可以特指整套核DNA （如核基因組），也可以特指細(xì)胞器基因組，如線粒體基因組或葉綠體基因組。所有生命都具有指令其生長(zhǎng)與發(fā)育、維持其結(jié)構(gòu)與功能所必需的遺傳信息，現(xiàn)在認(rèn)為，基因組包含生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)的總和。

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