微囊藻毒素（microcystins，MCs）是一類能誘發(fā)肝臟腫瘤的單環(huán)七肽化合物，其化學性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)水處理技術(shù)難以有效去除，而微生物法是去除MCs最安全和有效的方法。國內(nèi)外在微生物降解MCs方面做了大量研究，但在微生物降解MCs的途徑及其分子機理方面少有深入報道。本書以1株能高效降解MCs的菌株——鞘氨醇單胞菌USTB-05為研究對象，在菌體及降解酶對微囊藻毒素LR（MC-LR）降解特性研究的基礎(chǔ)上，獲取完整降解基因序列信息，并通過降解基因的克隆與表達、重組酶的活性驗證及降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)測定，深入研究鞘氨醇單胞菌USTB-05降解MC-LR的途徑與分子機理，為構(gòu)建高效降解MCs的基因工程菌奠定理論基礎(chǔ)。
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目錄
前言
第1章 緒論 1
1.1 MCs的物化特性、種類及其毒性 2
1.1.1 MCs的種類及其結(jié)構(gòu)特點 2
1.1.2 MCs的毒性 3
1.2 MCs的提純與分析檢測 4
1.2.1 MCs的提純 4
1.2.2 MCs的分析檢測 5
1.3 MCs的物理和化學去除法 6
1.3.1 物理法 6
1.3.2 化學法 7
1.4 MCs微生物降解研究進展 8
1.4.1 混合菌降解MCs 8
1.4.2 純菌種降解MCs 8
1.5 MCs降解途徑及分子機理研究進展 11
1.5.1 MCs酶催化降解 11
1.5.2 MCs微生物降解基因 11
1.5.3 MCs降解途徑及分子機理 12
1.6 USTB-05菌株簡介 15
第2章 研究的技術(shù)路線、研究方法與實驗條件 17
2.1 研究思路及技術(shù)路線 17
2.2 實驗條件 19
2.2.1 實驗材料 19
2.2.2 實驗設(shè)備 19
2.2.3 樣品測試方法 20
第3章 菌株USTB-05降解MC-LR的特性研究 22
3.1 實驗方法 22
3.1.1 USTB-05菌培養(yǎng) 22
3.1.2 MCs的提純 22
3.2 氧氣對USTB-05菌降解MC-LR的影響 22
3.3 溫度對USTB-05菌降解MC-LR的影響 23
3.4 初始pH對USTB-05菌降解MC-LR的影響 24
3.5 不同條件下USTB-05菌的生長情況 25
3.6 USTB-05菌對MC-LR的降解動力學 25
3.7 本章小結(jié) 26
第4章 菌株USTB-05降解MC-LR的基因特性研究 27
4.1 實驗方法 27
4.1.1 USTB-05菌無細胞提取液的制備 27
4.1.2 USTB-05菌基因組提取 27
4.1.3 質(zhì)粒的提取 28
4.1.4 DNA凝膠電泳 29
4.1.5 目的片段回收 29
4.1.6 目的基因與pGEM-T easy載體連接 29
4.1.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞 30
4.1.8 測序 31
4.2 USTB-05菌無細胞提取液降解MC-LR特性 31
4.3 降解基因序列初步探索 33
4.4 降解基因序列反向PCR擴增 35
4.5 USTB-05菌降解MC-LR完整基因序列信息 38
4.6 降解基因序列分析 41
4.7 本章小結(jié) 45
第5章 MC-LR降解基因的克隆 47
5.1 基本思路 47
5.2 PCR擴增 48
5.2.1 引物設(shè)計 48
5.2.2 PCR反應(yīng)條件 50
5.2.3 PCR反應(yīng)結(jié)果分析 51
5.3 陽性克隆鑒定 52
5.4 基因測序及比對 55
5.5 本章小結(jié) 56
第6章 重組蛋白的誘導表達與活性驗證 58
6.1 實驗方法 58
6.1.1 目的蛋白電泳 58
6.1.2 重組菌CE提取 59
6.2 重組蛋白誘導表達 59
6.3 包涵體驗證 61
6.4 重組菌A蛋白酶催化降解MC-LR活性驗證 63
6.5 重組菌B蛋白酶催化降解MC-LR及第一個產(chǎn)物 65
6.6 重組菌C蛋白酶催化降解MC-LR及第二個產(chǎn)物 67
6.7 重組菌C蛋白酶催化降解第一個產(chǎn)物 69
6.8 重組蛋白活性驗證歸納 70
6.9 本章小結(jié) 71
第7章 USTB-05菌降解MC-LR的途徑及分子機理探討 72
7.1 實驗方法 72
7.1.1 降解產(chǎn)物生成 72
7.1.2 降解產(chǎn)物純化 73
7.2 MC-LR降解產(chǎn)物質(zhì)譜分析 73
7.2.1 產(chǎn)物A質(zhì)譜分析 73
7.2.2 產(chǎn)物B質(zhì)譜分析 75
7.2.3 產(chǎn)物C及產(chǎn)物D質(zhì)譜分析 78
7.3 USTB-05菌降解MC-LR的途徑及分子機理 80
7.4 本章小結(jié) 83
第8章 結(jié)論與展望 85
8.1 主要結(jié)論 85
8.2 主要創(chuàng)新點 86
8.3 展望 86
參考文獻 87
附錄A USTB-05菌降解MC-LR完整基因序列信息 95
附錄B 微囊藻毒素LR降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)二級質(zhì)譜分析 102
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