目錄
譯者序
前言
第1章 大腸桿菌、質粒和噬菌體 1
1.1 培養(yǎng)基的制備及細菌學工具 2
1.1.1 極限培養(yǎng)基 2
1.1.2 豐富培養(yǎng)基 2
1.1.3 固體培養(yǎng)基 3
1.1.4 實驗工具 5
1.2 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)
1.2.1 基本方案1 過夜培養(yǎng) 5
1.2.2 基本方案2 大體積培養(yǎng) 6
1.2.3 基本方案3 利用計數(shù)極監(jiān)測生長情況 6
1.2.4 基本方案4 利用分光光度計監(jiān)測生長情況 6
1.3 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7
1.3.1 基本方案l 通過連續(xù)稀釋法滴定和分離細菌菌落 7
1.3.2 基本方案2 通過平板劃線法分離單菌落 7
1.3.3 基本方案3 通過鋪平板分離單個菌落 7
1.3.4 基本方案4 影印平板 7
1.3.5 輔助方案菌株的保存和復蘇 8
1.4 經典細菌遺傳學選論 8
1.5 質粒載體 13
質粒載體的選擇 13
1.6 質粒DNA 的小量制備 20
1.6.1 基本方案1 堿裂解小量制備 20
1.6.2 備選方案 96孔微量滴定板堿裂解法
1.6.3 基本方案2 煮沸小量制備法 22
1.7 質粒DNA 的大量制備 22
1.7.1 基本方案1 堿裂解法制備粗制裂解物 22
1.7.2 基本方案2 氯化銫/溴化乙錠平衡離心法 24
1.7.3 備擇方案利用陰離子交換層析或分子篩層析純化質粒DNA 25
1.8 將質粒DNA 導人細菌細胞
1.8.1 基本方案1 CaC12 轉化法
1.8.2 備擇方案一步法制備和轉化感受態(tài)細菌 27
1.8.3 基本方案2 高放率的電轉化方法 27
1.9 噬菌體概述 29
1.9.1 裂解性生長 29
1.9.2 溶源性生長 30
1.10 作為克隆載體的噬菌體 32
1.10.1 用噬菌體的優(yōu)點 32
1.10.2 選擇插入的DNA 32
1.10.3 噬菌體來源的克隆載體的圖譜 35
1.11 噬菌體鋪平板產生噬斑 35
1.11.1 基本方案1 通過連續(xù)稀釋法分離單個噬斑 35
1.11.2 基本方案2 噬菌體轉染和體外包裝構建 36
1.12 培養(yǎng)A 衍生的噬菌體載體 37
1.12.1 基本方案通過平板裂解制備噬菌體庫 37
1.12.2 備擇方案制備液體裂解物 38
1.13 從噬菌體裂解液中制備DNA 38
基本方案 通過分級平衡梯度離心制備DNA 38
1.14 源于絲狀噬菌體的載體 40
1.15 利用M13 噬菌體衍生載體制備單鏈DNA 43
基本方案 利用輔助噬菌體從質粒制備單鏈DNA 43
第2章 DNA 的制備和分析 45
電泳及其應用 45
凝股和電路 46
2.1 水溶液中DNA 的純化和濃縮 46
2.1.1 基本方案DNA 的盼抽提和乙薛沉淀 47
2.1.2 備擇方案1 異丙醇沉淀DNA 47
2.1.3 輔助方案1 丁醇濃縮DNA 48
2.1.4 輔助方案2 酷抽提法去除殘存醋、氯仿或丁醇 48
2.1.5 備擇方案2 硅膜離心柱法純化DNA 49
2.1.6 備擇方案3 RNA 及DNA 稀榕液的純化和濃縮 49
2.1.7 備擇方案4 乙酶沉淀法去除低分子質量的寡核背酸和核苷三磷酸 50
2.2 陰離子交換色譜法純化DNA 50
基本方案 50
2.3 從哺乳動物組織中制備基因組DNA 52
基本方案 52
2.4 從植物組織中制備基因組DNA 53
2.4.1 基本方案氧化鎧離心法制備植物DNA 53
2.4.2 備擇方案CTAB 制備植物DNA 54
2.5 從細菌中制備基因組DNA
2.5.1 基本方案細菌基因組DNA 的小量制備
2.5.2 備擇方案氧化鎧法大規(guī)模制備細菌基因組DNA 56
2.5.3 輔助方案從腳尋到的DNA 制備物中除去多糖 57
2.6 瓊脂糖凝膠電泳 57
2.6.1 基本方案DNA 片段在標準瓊脂糖凝股上的分離 57
2.6.2 輔助方案微型凝肢及中型凝肢 58
2.7 脈沖場凝肢電泳 59
2.7.1 基本方案倒轉電場凝肢電泳 59
2.7.2 備擇方案鉗位均勻電場電掠（CHEF電泳） 60
2.7.3 輔助方案高分子質量DNA 樣品和分子質量標準物的制備 61
2.8 從瓊脂糖凝膠中分離和純化大的DNA 限制酶切片段 62
2.8.1 基本方案1 瓊脂糖凝肢電挽脫 62
2.8.2 基本方案2 NA-45紙電泳 63
2.8.3 基本方案3 低熔點瓊脂糖凝肢分離DNA 64
2.8.4 備擇方案1 瓊脂糖酶消化法從低熔點瓊脂糖凝腔中回收DNA 65
2.8.5 備擇方案2 硅膜離心桂從低熔點瓊脂糖凝腔中回收DNA 65
2.8.6 輔助方案澳化乙鍵斑點定量法對DNA 濃度進行快速估測 66
2.9 常規(guī)凝膠電泳分離小分子DNA 片段 67
2.9.1 基本方案l 非變性聚丙烯酷腔凝肢電旅 67
2.9.2 備擇方案聚丙烯酷臘凝肢DNA 小片段的電洗脫 68
2.9.3 基本方案2 篩分型瓊脂糖提肢電掠 69
2.10 DNA 的毛細管電泳 69
2.10.1 基本方案1 寡核苷酸的分離 72
2.10.2 基本方案2 定量PCR 分析 73
2.10.3 備擇方案基因型分析 75
2.11 Southern 印跡法 75
2.11.1 基本方案用高鹽緩沖液在尼龍膜或硝酸纖維素膜上進行Southem 印跡 75
2.11.2 輔助方案紫外透射儀的校準 78
2.11.3 備擇方案1 用破性緩沖液在尼龍膜上進行Southem 印跡 78
2.11.4 備擇方案2 用向下毛細管轉移法進行Southem 印跡 79
2.11.5 備擇方案3 從聚丙烯酷腦凝肢至尼龍膜的電轉印法 79
2.12 DNA 的斑點和狹線印跡 80
2.12.1 基本方案用多樣抽濾加樣器在不帶電荷的尼龍膜和硝酸纖維素膜上進行DNA斑點和狹線印跡 80
2.12.2 備擇方案1 用多樣抽撞加樣器在帶正電荷的尼龍膜上進行DNA 斑點和狹線印跡 82
2.12.3 備擇方案2 DNA 斑點印跡的手工制備 82
2.13 DNA 印跡的雜交分析 82
2.13.1 基本方案制才性標記的DNA 探針對DNA 印跡的雜交分析 84
2.13.2 備擇方案用放射性標記的RNA 探針對DNA 印跡進行雜交分析 85
2.13.3 輔助方案從雜交膜上除去探針 87
2.14 寡核苷酸的合成及純化 89
2.14.1 關于核酸的化學合成潔的介紹 89
2.14.2 核酸合成方案 92
2.14.3 寡核苷酸純化方案 93
2.15 變性聚丙烯酷膠凝膠電泳純化寡核苷酸 94
基本方案 94
第3章 DNA 和RNA 的酶學操作 97
3.1 限制性內切核酸酶消化DNA 97
3.1.1 基本方案單酶切消化單個DNA 樣品 98
3.1.2 備擇方案l 多限制性內切核酸酶消化DNA 99
3.1.3 備擇方案2 消化多個DNA 樣品 101
3.1.4 備擇方案3 限制性內切核酸酶對DNA 部分消化 102
3.1.5 輔助方案DNA 的甲基化 102
3.2 核酸操作的常用試劑和放射性同位素 103
3.2.1 儲液溶液 103
3.2.2 10X 酶緩沖液 106
3.2.3 核苷蘭磷酸 110
3.2.4 標記核酸的放射性同位素 111
3.2.5 基本方案酸沉淀法測定DNA 和RNA 中的放射性 112
3.2.6 備擇方案柱離心法從未摻人的前體dNTP 分離放射性標記DNA 113
3.3 DNA 依賴的DNA 聚合酶 114
3.3.1 基本方案1 缺口翻譯標記DNA 114
3.3.2 基本方案2 DNA 的31端標記 115
3.3.3 基本方案3 修復凸出的3或5端以產生平端 116
3.3.4 基本方案4 隨機寡核苷酸尋|物介導的DNA 標記 116
3.3.5 天然T7 噬菌體DNA 聚合酶 118
3.3.6 經修飾的T7 噬菌體DNA 聚合酶 118
3.3.7 Taq DNA 聚合酶 119
3.4 不依賴于模板的DNA 聚合酶 119
末端脫氧核苷酸轉移酶（末端轉移酶）119
3.5 依賴RNA 的DNA 聚合酶 120
逆轉錄酶 120
3.6 依艘DNA 的RNA 聚合酶 121
噬菌體的RNA 聚合酶：SP6、T7 和T3 121
3.7 磷酸酶和激酶 122
3.7.1 細菌堿性磷酸酶（BAP） 和小牛腸堿性磷酸酶（CIP） 121
3.7.2 T4 噬菌體多核苷酸激酶 122
3.8 外切核酸酶 122
3.8.1 外切核酸酶VII （ exo VII） 122
3.8.2 噬菌體外切核酸酶（xo） 123
3.8.3 T7 噬菌體基因6 外切核酸酶 123
3.8.4 外切核酸酶III （exo III） 123
3.9 內切核酸酶 124
3.9.1 Bal 31核酸酶 124
3.9.2 Sl核酸酶 124
3.9.3 綠豆核酸酶 125
3.9.4 微球菌核酸酶 125
3.9.5 脫氧核糖核酸酶1 （DNA 酶1） 126
3.9.6 無RNA 酶活性的DNA 酶I 126
3.10 核糖核酸酶 127
3.10.1 核糖核酸酶A （RNA 酶A） 127
3.10.2 元DNA 酶的RNA 酶A 127
3.肌3 核糖核酸酶H （RNA 酶E 127
3.10.4 核糖核酸酶T1 128
3.11 DNA 連接酶 128
3.11.1 T4 幢菌體DNA 連接酶 128
3.11.2 大腸桿菌DNA 連接酶 129
3.12 RNA 連接酶 129
T4 RNA連接酶 129
3.13 DNA 片段的亞克隆 130
3.13.1 基本方案DNA 片段的亞克隆 130
3.13.2 備擇方案提肢塊中DNA 片段的連接 131
3.14 聚合酶鏈反應構建重組DNA 132
基本方案DNA 片段亞克隆 132
3.15 非同位素探針的標記和比色檢測 132
3.15.1 基本方案1 用切口平移法制備生物素酷化的探針 136
3.15.2 基本方案2 用隨機嘉核苦酸引物合成法制備生物素酷化探針 137
3.15.3 輔助方案生物章酷化探針的比包法檢測 138
3.15.4 備擇方案制備和檢測地高辛標記的DNA 探針 139
3.16 非同位素探針的化學發(fā)光檢測 139
3.16.1 基本方案生物素標記探針的化學發(fā)光檢測 140
3.16.2 備擇方案地高辛標記探針的化學發(fā)光撿測 142
3.16.3 輔助方案紫外光源的標準化 142
第4章 RNA 的制備和分析 144
4.1 異硫氨酸臟法制備總RNA 145
4.1.1 基本方案從組織或培養(yǎng)細胞中一步法分離RNA 145
4.1.2 備擇方案1 CsCl法純化從培養(yǎng)細胞中提取的RNA 146
4.1.3 備擇方案2 CsCl純化組織RNA 147
4.2 酣/SDS 法制備植物RNA 148
基本方案 148
4.3 制備細菌RNA 149
4.3.1 基本方案1 從革蘭氏陰性菌中分離高質量的RNA 149
4.3.2 備擇方案 革蘭氏回性菌中快速分離RNA 150
4.3.3 基本方案2 從革蘭民陽性菌分離RNA 151
4.4 poly（A）+RNA 的制備 152
基本方案 152
4.5 用單鏈DNA 探針進行mRNA 的S1 核酸酶作圖分析 153
4.5.1 基本方案用M13 模板進行mRNA 的51 作圖 154
4.5.2 備擇方案l 從現(xiàn)鏈質粒模板合成單鏈探針
4.5.3 備擇方案2 用寡核脊酸探針進行mRNA 的定量SI 分析 156
4.5.4 輔助方案51 核酸酶mRNA 定量分析的控制（參數(shù)） 157
4.6 核酸酶保護試驗 157
4.6.1 基本方案 157
4.6.2 輔助方案1 模板DNA 的制備 159
4.6.3 輔助方案2 RNA 探針的膠提純 159
4.7 引物延伸 160
基本方案 160
4.8 RNA 的Northern 印跡和狹線雜交分析 162
4.8.1 基本方案甲隆瓊脂糖凝肢電掠分離RNA 的Northem 雜交 162
4.8.2 備擇方案1 經乙工醒/工甲基亞楓處理的變性RNA N orthern 雜交 164
4.8.3 備擇方案2 經狹線印跡固定的未分級RNA 樣品的Northern 雜交 165
4.8.4 輔助方案Northern 印跡探針的除去 166
4.9 鑒定新轉錄的RNA 166
4.9.1 基本方案在哺乳動物細胞中的核失控轉錄 167
4.9.2 備擇方案1 用杜恩斯勻漿器分離細胞核 169
4.9.3 備擇方案2 藤椅梯度離心分離細胞核 169
4.9.4 輔助方案制備用于核失控轉錄實驗的硝酸纖維素膜 170
第5章 重組DNA 文庫的構建 172
5.1 基因組DNA 文庫概述 174
5.1.1 代表性與隨機性 174
5.1.2 亞基因組文庫 174
5.1.3 基因組DNA 文庫載體 175
5.2 cDNA 文庫概述 175
5.3 噬菌體文庫的擴增 176
基本方案 176
5.4 薪粒和質位文庫的擴增 177
基本方案 177
第6章 重組DNA 文庫的篩選 179
6.1 噬菌體文庫的鋪平板和轉移 181
基本方案噬菌體文庫的鋪平板和轉移 181
6.2 薪粒及質位文庫的鋪平板和轉移 182
基本方案甜粒及質粒文庫的鋪平板和轉移 182
6.3 應用DNA 片段作探針 183
6.3.1 基本方案在甲酷臘榕液中雜交 184
6.3.2 備擇方案在水禧液中雜交 184
6.4 使用合成寡核背酸作探針 185
6.4.1 基本方案在氯化鈾/擰楝酸鈾溶液（C） 中雜交 184
6.4.2 備擇方案在氧化四甲鍍（TMAC） 中雜交 186
6.4.3 輔助方案棍合寡核脊酸5端標記 188
6.5 噬菌體克隆的純化 189
基本方案 189
6.6 黏粒和質�？寺〉募兓� 190
基本方案 190
6.7 在噬菌體噬斑中產生的融合蛋白的免疫篩選 190
6.7.1 基本方案用抗體篩選gt表達文庫 190
6.7.2 備擇方案在抗體篩選之前用IPTG 誘導融合蛋白表達 191
6.8 在雜交選擇和翻譯后進行的免疫篩選 192
基本方案 192
6.9 用單克隆抗體表達克隆 194
6.9.1 基本方案分離編碼細胞表面抗原的cDNA 克隆 194
6.9.2 輔助方案1 抗體包被乎板的制備 197
6.9.3 備擇方案分離編碼細胞內抗原的cDNA 克隆 197
6.9.4 輔助方案2 制備聚偏二乙烯膜包裹的平板 199
6.10 基于重組方法（RBA ） 以篩選k 噬菌體文庫 199
基本方案 199
第7章 DNA 序列測定 204
雙脫氧（Sanger） 測序法 205
化學（Maxam-G曲創(chuàng)）測序法 207
雙脫氧法或化學測序法的選擇 208
放射性標記測序反應的替代 208
其他測序技術的進展 209
計辭機分析 210
7.1 DNA 測序策略 210
7.1.1 雙脫氧測序 211
7.1.2 化學測序 214
7.2 構建用于DNA 測序的嵌套式缺失體 215
7.2.1 基本方案1 用外切酶III 構建單向缺失突變體 215
7.2.2 備選方案用[a-35 S] dNTP 使DNA 免于外切酶III渭化 218
7.2.3 基本方案2 用Bal31 核酸酶構建嵌套式缺失突變體 219
7.3 制備DNA 測序模板 223
7.3.1 基本方案l 制備單鏈M13 噬菌體DNA 223
7.3.2 基本方案2 從小量裂解物中制備k 噬菌體DNA 224
7.3.3 基本方案3 小量制備用于化學測序的重組pSP64CS 或pSP65CS 質粒DNA 225
7.3.4 基本方案4 小量制備用于雙脫氧測序的雙鏈質粒DNA 226
7.3.5 基本方案5 用于雙脫氧測序的雙鏈質�；騥 噬菌體DNA 的堿變性 227
7.3.6 基本方案6 制備用于熱循環(huán)測序質�；蚴删�體DNA 227
7.4 雙脫氧法DNA 測序 228
7.4.1 基本方案l 用測序酶（經修飾的T7 噬菌體DNA 聚合酶）進行標記/終止測序反應 230
7.4.2 備擇方案l 使用測序酶和MnH 的標記/終止測序反應 232
7.4.3 備擇方案2 使用TaqDNA 聚合酶進行Sanger 測序反應 232
7.4.4 備擇方案3 用5'端標記引物進行一步法測序反應 233
7.4.5 基本方案2 用e標i己核苷酸進行熱循環(huán)測序反應 234
7.4.6 備擇方案4 用5'端標記引物進行熱循環(huán)測序反應 236
7.4.7 備擇方案5 使用熒光染料標記的引物和終止物進行循環(huán)測序 236
7.5 化學發(fā)光雙脫氧DNA 測序法 238
7.5.1 基本方案利用生物素標記引物的化學發(fā)光DNA 測序法 239
7.5.2 備擇方案1 鏈霉親和素和生物素酷化堿性磷酸酶兩步檢測法（間接法） 242
7.5.3 各擇方案2 用半抗原標記引物進行測序并用抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物檢測 242
7.6 化學測序法 243
7.6.1 基本方案用P標記的DNA 進行化學測序 244
7.6.2 輔助方案Tth111消化和未端標記 246
7.7 用于測序的變性凝膠電泳 247
7.7.1 基本方案測序臟的灌制、電掠及處理 248
7.7.2 備擇方案l 韁沖液梯度測序肢 251
7.7.3 備擇方案2 電解質梯度測序肢 251
7.7.4 備擇方案3 含甲酷膠的測序股 252
第8章 克隆化DNA 的誘變 253
8.1 用簡并寡核苷酸在小段DNA 序列中產生大量突變 254
基本方案 254
8.2 基因合成：用互為引物的長段寡核苷酸組合目的序列 257
基本方案 257
8.3 PCR 介導的隨機突變 258
8.3.1 基本方案DNA 序列的突變 259
8.3.2 各擇方案一個序列文庫的突變 261
8.4 DNA 的接頭分區(qū)誘變 262
基本方案 262
8.5 PCR 介導的誘變 264
8.5.1 基本方案1 通過PCR 引人限制酶切位點 264
8.5.2 基本方案2 利用PCR 引入點突變 267
8.5.3 備擇方案通過連續(xù)PCR 引人點突變 270
第9章 DNA 導入哺乳動物細胞 271
轉染方法的選擇 271
優(yōu)化轉染條件 272
病毒載體 273
哺乳動物細胞培養(yǎng) 274
9.1 磷酸鈣轉染法 276
9.1.1 基本方案磷酸鈣-DNA 在HEPES 中形成祝淀的轉染方法 276
9.1.2 輔助方案哺乳動物細胞的甘油/二甲基亞楓休克 277
9.1.3 備擇方案在BES 中形成的磷酸鈣DNA 沉淀高效轉染 277
9.2 DEAE-葡聚糖轉染 278
9.2.1 基本方案DEAE葡聚糖轉染法的基本操作程序 278
9.2.2 備擇方案樣本實驗2 檢測酶的結構/活性關系 280
9.3 電穿孔轉染法 281
9.3.1 基本方案電穿孔法轉染哺乳動物細胞 281
9.3.2 備擇方案植物原生質體細胞的電穿孔轉染 281
9.4 陽離子脂質體介導的真核細胞轉染 282
9.4.1 基本方案1 陽離子脂質體介導DNA 的哺乳動物貼壁細胞轉染 283
9.4.2 備擇方案陽離子增強脂質體介導DNA 的哺乳動物貼壁細胞轉染 284
9.4.3 基本方案2 陽離子脂質體介導DNA 的懸浮細胞轉染 285
9.4.4 基本方案3 陽離子脂質體介導RNA 的貼壁細胞轉染 285
9.4.5 基本方案4 陽離子脂質體介導桿狀病毒DNA的和昆蟲貼壁細胞轉染 286
9.4.6 輔助方案陽離子脂質體轉染優(yōu)化條件的微調 286
9.5 轉染哺乳動物細胞的選擇 288
9.5.1 策略安排 288
9.5.2 基本方案l 哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉染 290
9.5.3 基本方案2 哺乳動物細胞的選擇標記 291
9.6 遺傳報道基因系統(tǒng)概述 295
9.6.1 報道載體的設計 299
9.6.2 體外報道分子分析方法 299
9.7 報道基因活性的同位素分析方法 304
9.7.1 基本方案1 CTA 活性的色譜分析法 304
9.7.2 備擇方案1 原位裂解細胞的CAT 分析方法 306
9.7.3 備擇方案2 CAT 活性的相抽提分析法 306
9.7.4 基本方案2 人生長激素的放射免疫分析法 307
9.8 非同位素分析報道基因活性 309
9.8.1 基本方案1 螢火蟲螢光素酶報道基因分析 309
9.8.2 備擇方案凍融裂解的細胞的螢光素酶分析 310
9.8.3 基本方案2 一半乳糖苷酶報道基因的化學發(fā)光分析 311
9.9 用維多利亞水母綠色熒光蛋白CGFP） 研究體內蛋白動力學 312
9.9.1 GFP 的應用 312
9.9.2 GFP 的問題 313
9.9.3 GFP 突變體 314
9.9.4 顯微鏡設置 314
9.10 逆轉錄病毒轉導系統(tǒng)概述
9.10.1 逆轉錄病毒生活周期
9.10.2 有復制能力的載體 317
9.10.3 元復制能力的載體 318
9.10.4 包裝細胞系和病毒的產生 320
9.10.5 鼠逆轉錄病毒 323
9.以6 禽逆轉錄病毒 324
9.10.7 安全性問題 324
9.11 建立特異的逆轉錄病毒產毒細胞系 325
9.11.1 基本方案將逆轉錄病毒載體導人包裝細胞系 325
9.11.2 基本方案2 測定病毒滴度2 高滴度產病毒細胞克隆的鑒定分離 327
9.11.3 備擇方案產毒克隆的快速評價 328
9.11.4 輔助方案培養(yǎng)細胞的X-gal 染色 328
9.12 制備高滴度逆轉錄病毒上清的瞬時轉染方法
9.12.1 基本方案1 將逆轉錄病毒載體瞬時轉染人293 細胞系 329
9.12.2 輔助方案293 細胞的生長和保存 330
9.12.3 基本方案2 用逆轉錄病毒上清感染貼壁細胞 332
9.12.4 備擇方案1 旋轉感染法感染貼壁細胞 332
9.12.5 基本方案3 用逆轉錄病毒上清感染非貼壁細胞 333
9.12.6 備擇方案2 共培養(yǎng)感染非貼壁細胞 333
9.12.7 備擇方案3 旋轉感染法感染非貼壁細胞 334
9.13 大規(guī)模制備和濃縮逆轉錄病毒原液
9.13.1 基本方案用離心法制備和濃縮病毒原液
9.13.2 備擇方案1 用聚乙二障沉淀及層析法濃縮病毒
9.13.3 備擇方案2 用分子質量截留濾膜進行濃縮
9.14 逆轉錄病毒原液中輔助病毒的檢測 337
9.14.1 基本方案通過藥物抗性的水平傳播鑒定輔助病毒 337
9.14.2 備擇方案1 用原病毒檢測具復制能力的逆轉錄病毒 338
9.14.3 備擇方案2 用逆轉錄酶分析法檢測輔助病毒 338
9.15 用逆轉錄病毒在體外及體內感染細胞 339
體外細胞感染 339
第10章 蛋白質分析 343
蛋白質分類 343
蛋白質純化流程圖 344
10.1 分光光度分析法和比色法測定蛋白質濃度 350
10.1.1 基本方案1 應用A280來測定蛋白質濃度 350
10.1.2 基本方案2 應用Bradford 法測定蛋白質濃度 350
10.2 定量氨基酸的分析 351
10.2.1 樣品準備 351
10.2.2 討算平均組成 352
10.3 蛋白質的單向SDS 凝膠電泳 353
10.3.1 電與電泳 353
10.3.2 安全性考慮 353
10.3.3 歐姆定律和電泳 354
10.3.4 基本方案1 變性（SDS） 不連續(xù)凝肢電泳：Laemmli 凝臟法 355
10.3.5 備擇方案1 Tris-tricine 緩沖液系統(tǒng)的PAGE 電泳 358
10.3.6 備擇方案2 在無尿素條件下用Tris 緩沖液分離多膚 360
10.3.7 備擇方案3 連續(xù)SDS 聚丙烯酷膠凝肢電泳 361
10.3.8 備擇方案4 超薄凝肢的PAGE 362
10.3.9 輔助方案1 一次灌制多塊單一濃度凝膠 363
10.3.10 備擇方案5 在梯度凝肢中分離蛋白質 365
10.3.11 輔助方案2 一次灌制多塊梯度肢 367
10.3.12 基本方案Z 在單一濃度的微型凝肢上電泳 368
10.3.13 輔助方案3 制各多塊梯度肢 370
10.4 使用Farrell 系統(tǒng)的雙向凝膠電泳 371
10.4.1 基本方案1 第一向凝肢（等電聚焦） 371
10.4.2 備擇方案1 極端堿性、酸性蛋白質的等電聚焦 373
10.4.3 基本方案2 第二向凝肢 374
10.4.4 備擇方案2 小型凝肢雙向電泳 376
10.4.5 輔助方案組織來源的蛋白質樣品的溶解和制備 377
10.5 凝膠中蛋白質的染色 377
10.5.1 基本方案1 考馬斯亮藍染色 377
10.5.2 備擇方案1 考馬斯亮藍快染 378
10.5.3 基本方案2 銀染法 378
10.5.4 備擇方案2 非氨鹽銀染法 379
10.5.5 基本方案3 快速銀染法 380
10.5.6 輔助方案1 考馬斯亮藍和銀染染色的凝膠拍照 381
10.5.7 基本方案3 熒光染色 382
10.5.8 備擇方案4 非變性肢的熒光染色 382
10.5.9 輔助方案2 熒光染色肢的拍照 383
10.6 免疫印跡和免疫檢測 383
10.6.1 基本方案1 用轉移槽轉印蛋白質 383
10.6.2 備擇方案1 用半干轉移系統(tǒng)轉印蛋白質 385
10.6.3 備擇方案2 染色凝肢的印跡 386
10.6.4 輔助方案1 轉印蛋白的可避染色 387
10.6.5 基本方案2 用第三抗體偶聯(lián)物進行免疫檢測 387
10.6.6 備擇方案3 用親和素生物素偶聯(lián)的第二抗體進行免疫檢測 388
10.6.7 基本方案3 用發(fā)色底物顯跡 389
10.6.8 備擇方案4 用發(fā)光底物顯跡 390
10.6.9 輔助方案2 膜的清洗和再使用 391
10.7 凝膠過濾層析 391
10.7.1 基本方案1 脫鹽（組分分離） 391
10.7.2 基本方案2 蛋白質的分級 397
10.7.3 基本方案3 分子大小的測定 400
10.7.4 輔助方案柱校正 401
10.8 離子交換層析 404
10.8.1 設計策略 404
10.8.2 基本方案1 批式吸附和增加鹽濃度的階段梯度就脫 405
10.8.3 基本方案2 線性梯度洗脫的柱層析 407
10.8.4 輔助方案進行小試確定離子交換層析的起始條件 409
10.9 免疫親和層析 414
10.9.1 基本方案可癖性或膜結合抗原的分離 414
10.9.2 備擇方案1 抗原的批式純化 416
10.9.3 備擇方案2 低pH 挽脫抗原 416
10.10 金屬整合親和層析 417
10.10.1 基本方案天然MCAC 對可溶性組氨酸尾融合蛋白的純化 417
10.10.2 備擇方案1 變性條件下用MCAC 純化帶組鯨酸尾的不禧性融合蛋白 420
10.10.3 備擇方案2 MCAC 純化蛋白質的固相復性 421
10.10.4 輔助方案NTA 介質的再生 421
10.11 多膚和蛋白質的HPLC準備工作和系統(tǒng)組裝 422
10.11.1 多膚和蛋白質的屬性及其在HPLC 方法發(fā)展的應用 422
10.11.2 HPLC 中多膚和蛋白質的檢測 422
10.11.3 起始程序 423
10.11.4 樣品的準備 425
10.11.5 準備流動相 425
10.11.6 組裝HPLC 裝置 426
10.11.7 用攬脫液活化泵和低壓線 426
10.11.8 HPLC 系統(tǒng)的準備 426
10.11.9 HPLC 系統(tǒng)的梯度延梅（滯留體積） 427
10.11.10 和柱連接 428
10.11.11 給HPLC 裝置設計程序 428
10.11.12 注射樣品 428
10.11.13 檢測功能性HPLC 系統(tǒng)428
10.11.14 日志 428
10.12 多膚和蛋白質的HPLC：標準操作條件 429
10.12.1 HP- SEC 的標準操作條件 430
10.12.2 HP-NPC 的標準操作條件 431
10.12.3 HP-HIC 的標準操作條件 432
10.12.4 HP- IEX 的標準操作條件 433
10.12.5 HP-HILIC 的標準操作條件 434
10.12.6 HP-IMAC 的標準操作條件 435
10.12.7 HP-BAC 的標準操作條件 436
10.12.8 RP-HPLC 的標準操作條件 437
10.12.9 用RP-HPLC 技術對多膚和蛋白質溫合物脫鹽 440
10.13 膚的反相分離 441
10.13.1 基本方案1 5-500PMOL 水平膚的反相分離 441
10.13.2 基本方案2 不超過5 pmol 膚的反相分離 442
10.13.3 輔助方案毛細管HPLC 系統(tǒng)的裝配 443
10.14 通過表位標簽純化重組蛋白研究蛋白質互相作用 444
基本方案帶表位標簽重組蛋白的免疫沉淀 444
10.15 免疫沉淀 446
10.15.1 基本方案1 用非變性去垢劑溶液裂解的懸浮細胞的免疫沉淀 446
10.15.2 備擇方案1 用非變性去垢劑榕液裂解的貼壁細胞的免疫沉淀 449
10.15.3 備擇方案2 用變性去垢劑裂解的細胞的免疫沉淀 450
10.15.4 備擇方案3 不用去垢劑裂解的細胞的免疫沉淀 450
10.15.5 備擇方案4 用抗體-Sepharose 偶聯(lián)物免疫沉淀 451
10.15.6 輔助方案制備抗體-Sepharose 偶聯(lián)物 453
10.15.7 各擇方案5 用抗Ig 血清免疫祝淀放射性標記抗原 454
10.15.8 基本方案2 免疫沉淀一重俘獲 455
10.16 克隆化基因的體外轉錄和翻譯 456
基本方案 456
10.17 氨基酸代謝標記 458
10.17.1 標記復合物操作的安全預防 458
10.17.2 基本方案標記甲硫氨酸對懸浮培養(yǎng)細胞的脈沖標記 459
10.17.3 各擇方案1 貼壁細胞的[35 S] 甲硫氨酸脈沖標記 460
10.17.4 備擇方案2 甲硫氨酸脈沖示蹤標記細胞 460
10.17.5 備擇方案3 甲硫氨酸的長期細胞標記 461
10.17.6 備擇方案4 用其他放射性標記的氨基酸進行代謝標記 461
10.17.7 輔助方案TCA 祝淀測定標記摻入量 462
10.18 分離蛋白質用于微量序列分析 463
10.18.1 基本方案1 測定通過SDS-PAGE 轉移到PVDF 膜上樣品的氨基酸序列 463
10.18.2 輔助方案準備SD S-PAGE 蛋白質樣品 465
10.18.3 基本方案Z 測定N 端封閉蛋白質的內部序列 466
10.19 蛋白質和多膚的毛細管電泳 467
10.19.1 使用儀器 467
10.19.2 戰(zhàn)略計劃 469
10.19.3 基本方案1 等電點聚焦分離蛋白質 469
10.19.4 基本方案2 蛋白質的分離 470
10.19.5 基本方案3 解析多膚的分離 471
10.19.6 基本方案4 微量制備毛細管電泳多次分離 472
10.19.7 備擇方案微量制備毛細管電泳單次分離 473
第11章 免疫學 475
11.1 酶與抗體的偶聯(lián) 477
11.1.1 基本方案辣根過氧化物酶HRPO 與抗體的偶聯(lián) 477
11.1.2 備擇方案堿性磷酸酶與抗體的偶聯(lián) 478
11.2 酶聯(lián)免疫吸附分析（ ELISA） 478
11.2.1 基本方案間接ELISA 法檢測特異性抗體 479
11.2.2 備擇方案1 直接競爭ELISA 法檢測可溶性抗原 480
11.2.3 備擇方案2 抗體夾心ELASA 法檢測可潛性抗原 481
11.2.4 備擇方案3 雙抗體夾心ELISA 檢測特異性抗體 482
11.2.5 備擇方案4 直接細胞ELISA 法檢測細胞表面抗原 483
11.2.6 備擇方案5 間接細胞ELISA 法檢測對表面抗原具有特異性的抗體 484
11.2.7 輔助方案1 正交連續(xù)稀釋法確定最佳試劑濃度 485
11.2.8 輔助方案2 制備細菌裂解物抗原 486
11.3 老鼠的免疫 487
11.3.1 基本方案制備免疫脾細胞：用可溶性抗原致敏 487
11.3.2 備擇方案1 用復合抗原（膜、整個細胞和微生物）進行免疫 488
11.3.3 備擇方案2 用電泳分離的抗原進行免疫 488
11.4 單克隆抗體上清和腹水的制備 488
11.4.1 基本方案1 單克隆抗體上清的制備 489
11.4.2 備擇方案1 單克隆抗體上清的大量制備 489
11.4.3 備擇方案2 大量制備雜交瘤或細胞系 490
11.4.4 基本方案2 含單克隆抗體的腹水的制備 491
11.5 單克隆抗體的純化 492
11.5.1 基本方案用蛋白A-瓊脂糖進行純化 492
11.5.2 備擇方案1 蛋白A-瓊脂糖的備擇緩沖液系統(tǒng) 493
11.5.3 備擇方案2 用抗原一葡聚糖和抗鼠Ig-葡聚糖進行純化 493
11.6 多克隆抗血清的制備 494
11.6.1 基本方案用弗民佐劑免疫制備多克隆抗體 495
11.6.2 備擇方案應用其他佐劑制備多克隆抗血清 496
11.6.3 輔助方案由全血制備血清 497
11.7 從抗血清、腹水或雜交瘤上清液中純化免疫球蛋白G組分 497
11.7.1 基本方案用飽和硫酸鍍沉淀IgG 497
11.7.2 備擇方案用DEAE-Affi-Gel Blue層析法分級分離IgG 498
11.8 免疫原性膚的選擇 499
11.9 抗膚抗體的制備 501
11.9.1 基本方案通過化學偶聯(lián)法用MB5 將合成膚偶聯(lián)到載體蛋白上 501
11.9.2 備擇方案用戊工醒將合成膚通過化學偶聯(lián)法交聯(lián)到載體蛋白上 502
第12章 DNA 蛋白質相互作用 503
12.1 從哺乳動物細胞中制備核和細胞質提取物 505
12.1.1 基本方案核提取物的制備 505
12.1.2 輔助方案1 細胞核提取方法的優(yōu)化 508
12.1.3 輔助方案2 細胞質（S-100） 組分的制備 508
12.2 DNA 結合在凝肢電泳中的遷移率變動分析 509
12.2.1 基本方案遷移率變動分析 510
12.2.2 備擇方案1 競爭遷移率變動分析 512
12.2.3 備擇方案2 抗體超變動分析 512
12.2.4 備擇方案3 多元遷移率變動分析 513
12.3 用來分析蛋白質-DNA 相互作用的甲基化和尿嘧啶干擾分析法 514
12.3.1 基本方案1 甲基化干擾分析法 514
12.3.2 基本方案2 尿嘧啶干擾分析法 515
12.4 DNA 酶I足跡分析法 517
12.4.1 基本方案DNA 酶I足跡滴定 518
12.4.2 輔助方案用光密度及數(shù)值分析法決定蛋白質結合的平衡常數(shù) 520
12.4.3 輔助方案租制品的DNA 酶足跡分析法 522
12.5 蛋白質與核酸的紫外交聯(lián) 524
12.5.1 基本方案用澳脫氧尿苷（ BrdU）取代的探針進行紫外交聯(lián) 524
12.5.2 備擇方案1 用非澳脫氧尿苷（BrdU）取代的探針進行紫外交聯(lián) 526
12.5.3 備擇方案2 原位紫外交聯(lián) 527
12.6 用生物素/鏈霉親和素親和系統(tǒng)純化DNA 結合蛋白 527
12.6.1 基本方案用生物素/鏈霉親和素親和系統(tǒng)純化DNA 結合蛋白 527
12.6.2 備擇方案1 用微型柱進行純化 527
12.6.3 備擇方案2 用鏈霉親和素瓊脂糖進行純化 530
12.7 編碼DNA 結合蛋白的cDNA 克隆的檢測、純化和鑒定 530
12.7.1 基本方案用位點識別DNA 篩選gtll表達文庫 531
12.7.2 備擇方案用鹽酸阻進行干燥膜的變性/復性循環(huán) 533
12.7.3 輔助方案從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA 結合蛋白的活性 533
12.8 用克隆化基因在體外合成的蛋白質分析DNA-蛋白質相互作用 535
基本方案 535
12.9 序列特異性DNA 結合蛋自的親和層析純化 536
12.9.1 基本方案1 DNA 親和介質的制備 536
12.9.2 備擇方案將DNA 偶聯(lián)于澳化氨活化的瓊脂糖上 539
12.9.3 輔助方案1 用制備性凝肢電泳純化寡核苷酸 539
12.9.4 基本方案2 DNA 親和層析法 541
12.9.5 輔助方案2 非特異競爭性DNA 的選擇和制備 543
12.10 PCR 輔助的結合位點選擇確定蛋白質-DNA 序列的特異性 544
12.10.1 基本方案 544
12.10.2 備擇方案從遷移率變動凝肢中分離和分析結合的寡核苷酸 548
第13章 釀酒酵母 550
13.1 酵母菌培養(yǎng)基的制備 551
13.1.1 液體培養(yǎng)基 552
13.1.2 固體培養(yǎng)基 554
13.1.3 菌株的保存與復蘇 557
13.2 酵母菌的培養(yǎng)與操作 558
13.2.1 基本方案1 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 558
13.2.2 基本方案2 固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 559
13.2.3 基本方案3 細胞密度檢測 559
13.2.4 基本方案4 影印平板檢測酵母菌表型 559
13.2.5 基本方案5 交配型的確定 559
13.2.6 菌株的構建和四分體抱子的分析 560
13.2.7 輔助方案解剖針的制作 565
13.2.8 備擇方案隨機抱子分析 565
13.3 酵母菌基因組轉座子的誘變 566
13.3.1 戰(zhàn)略計劃 567
13.3.2 基本方案利用mTn誘變文庫DNA 得到酵母菌突變體 567
13.3.3 輔助方案1 小載體聚合酶鏈反應 569
13.3.4 輔助方案2 mTn 誘變基因產物的表位標記 571
13.4 酵母菌載體與克隆基因表達產物的檢測 573
13.4.1 基本方案1 構建lacZ融合載體研究酵母菌基因調控 573
13.4.2 基本方案2 半乳糖苷酶在被體培養(yǎng)基中的檢測 573
13.4.3 備擇方案利用濾紙?zhí)崛�檢測法篩選表達β半乳糖苷酶的酵母菌落 574
13.5 將DNA 導人酵母細胞 575
13.5.1 基本方案乙酸鏗轉化 575
13.5.2 備擇方案電穿孔轉化 576
13.5.3 輔助方案單鏈高分子質量載體DNA 的制備 578
13.6 利用互補作用克隆酵母菌基因 579
基本方案 579
13.7 酵母細胞中質粒的加工 581
13.7.1 基本方案1 從酵母細胞中分離質粒 581
13.7.2 基本方案2 穿梭質粒 581
13.7.3 基本方案3 定位突變質粒缺口修復技術和等位基因修復技術 583
13.8 克隆化酵母DNA 的加工 584
13.8.1 基本方案1 整合性轉化 584
13.8.2 基因置換技術 585
13.8.3 基本方案5 一步整合置換產生修飾基因 589
13.8.4 備擇方案2 通過移換產生修飾基因 590
13.8.5 基本方案6 通過銅誘導雙重關閉技術產生條件等位基因 590
13.9 酵母DNA 的制備 592
13.9.1 基本方案從酵母菌中快速分離質粒DNA 592
13.9.2 備擇方案酵母染色體DNA 的快速分離 593
13.10 酵母菌RNA 的制備 594
13.1 0.1 基本方案熱酸性酣抽提法制備酵母RNA 594
13.10.2 備擇方案I 玻璃珠制備RNA 595
13.10.3 備擇方案2 poly （A）+ RNA 的制備 595
13.11 制備酵母蛋白抽提物 596
13.11.1 基本方案原生質球制備及裂解 596
13.11.2 輔助方案差速離心法制各細胞核 597
13.11.3 備擇方案1 玻璃珠破細胞法 598
13.11.4 備擇方案2 液氮破細胞法 598
第14章 原位來交和免疫組織化學 600
14.1 組織、胚胎及單細胞的固定、包埋及切片 601
14.1.1 基本方案組織和胚胎的多聚甲醛固定及石蠟包埋 601
14.1.2 備擇方案懸潭及培養(yǎng)細胞的PFA 固定 602
14.1.3 輔助方案1 成年小鼠的灌注 603
14.1.4 輔助方案2 蠟塊中樣本的切片 604
14.1.5 輔助方案3 包被載玻片的制備 605
14.2 冰涼切片 605
14.2.1 基本方案樣本制備及切片
14.2.2 輔助方案1 用于原位雜交的冰凍切片的固定 608
14.2.3 輔助方案2 組織固定和直在糖灌注 609
14.3 細胞RNA 的原位雜交 609
14.3.1 基本方案細胞的石蠟切片雜交實驗 610
14.3.2 備擇方案冰凍切片的雜交 613
14.3.3 輔助方案1 合成35 s-標記的核糖核酸探針 614
14.3.4 輔助方案2 35 S 標記的雙鏈DNA 探針的合成 616
14.4 雜交探針的檢測 616
14.4.1 基本方案1 膠片放射自顯影 616
14.4.2 基本方案2 乳膠放射自顯影 616
14.4.3 輔助方案蝴才自顯影用稀釋享L臟的制備 617
14.5 放射自顯影原位雜交玻片的復染和壓片固定 618
14.5.1 基本方案吉姆薩（Giemsa） 染色 618
14.5.2 備擇方案1 蘇木精/伊虹染色
14.5.3 備擇方案2 甲苯膠藍染色 620
14.5.4 備擇方案3 HOECHST 染包法 620
14.6 免疫組織化學法 621
14.6.1 基本方案1 單層生長細胞的免疫熒光標記 623
14.6.2 備擇方案1 懸浮細胞的免疫熒光標記 623
14.6.3 基本方案2 組織切片的免疫熒光標記 624
14.6.4 備擇方案2 鏈霉親和素生物素結合物免疫熒光標記 625
14.6.5 備擇方案3 組織切片的免疫金標記 626
14.6.6 備擇方案4 組織切片的免疫過氧化物酶標記 626
14.6.7 備擇方案5 組織切片的免疫熒光雙標記法 627
14.7 用非同位素探針進行原位雜交和檢測 627
14.7.1 基本方案熒光原位雜交 627
14.7.2 雜交信號的放大 629
14.7.3 非同位素標記探針的酶法檢測 631
14.8 原位PCR 和雜交檢測低豐度的靶核酸 633
14.8.1 總體設計 633
14.8.2 基本方案1 用RNA 的原位逆轉錄進行DNA 和RNA 靶序列的ISPCR 擴增 636
14.8.3 備擇方案一步法逆轉錄及擴增 640
14.8.4 基本方案2 ISPCR 擴增的靶產物的雜交和檢測 641
14.8.5 輔助方案1 AES 浸泡處理載玻片的制備 644
14.8.6 輔助方案2 在載玻片上制備原位PCR 樣本 645
14.8.7 輔助方案3 用33 P 標記寡核苦酸探針 646
14.9 RNA 在脊椎動物的胚胎和器官中的整體標本原位雜交和檢測 646
14.9.1 基本方案1 小鼠或者雞的胚胎以及椿宮中的整體原位雜交 647
14.9.2 基本方案2 小鼠胚、雞胚或者器官中RNA 雜交的酶學檢測 648
14.9.3 備擇方案1 非洲爪瞻的整體原位雜交 650
14.9.4 備擇方案2 非洲爪瞻胚胎RNA 雜交的酶學檢測 652
14.9.5 輔助方案1 地高辛標記的RNA 探針的合成 653
14.9.6 輔助方案2 用胚胎預吸收Fah 片段 654
14.10 熒光顯微鏡的原理及使用 655
14.10.1 熒光分子探針 657
14.10.2 濾光器以及撞光設備 657
14.10.3 多頻帶的濾鏡和多燃料熒光 658
14.10.4 光源 658
14.10.5 顯微鏡的物鏡
14.10.6 圖片分辨率和點散布函數(shù)（PSF） 659
14.10.7 活細胞的熒光顯微鏡檢術 660
14.10.8 兔疫標記2 標記固定細胞和組織的一般步驟 661
14.11 共聚焦顯微術基本原理 664
14.11.1 光分割的原理 666
14.11.2 共聚焦顯微鏡的類型 667
14.11.3 實際操作指南 669
14.12 原位雜交的測量 675
14.12.1 基本方案通過磷光核存儲影像決定原位雜交中的時才性同位素標記的異摞雙鏈體的分布 675
14.12.2 輔助方案制備參考體系 677
14.13 細胞凋亡的形態(tài)：生化性質和流式細胞儀檢測 678
14.13.1 基本方案I 使用活體熒光染料的顯微鏡定量凋亡指數(shù)和細胞活力 678
14.13.2 基本方案2 用次Go /Gl DNA 峰值計算細胞凋亡 680
14.13.3 基本方案3 用TUNEL 流式細胞定量凋亡細胞 681
14.13.4 基本方案4 通過TUNEL 組織切西中的凋亡細胞的原位雜交 683
14.14 冉半乳糖苷酶活性的整體封片免疫組化檢測 684
14.14.1 基本方案~半乳糖苦酶活性的整體封片染色和免疫組化檢測 684
14.14.2 備擇方案準備大組織的厚切片進行β半乳糖苷酶染色 686
14.14.3 輔助方案1 保存和組織清洗 686
14.14.4 輔助方案2 石蠟包埋、切片和染色 687
第1S章 黯合酶鏈反應CPα） 689
15.1 PCR 擴增DNA：標準程序和優(yōu)化 690
基本方案PCR 擴增DNA：標準程序和優(yōu)化 690
15.2 利用PCR 產物直接進行DNA 序列測定 696
15.2.1 基本方案1 不對稱PCR 產生的單鏈產物的雙脫氧測序 697
15.2.2 備擇方案1 單引物重復擴增制備單鏈模板以用于雙脫氧測序 697
15.2.3 備擇方案2 制備用于雙脫氧測序的雙鏈PCR 產物 698
15.2.4 備擇方案3 用噬菌體外切核酸酶消化雙鏈PCR 產物得到單鏈進行雙脫氧測序 699
15.2.5 基本方案2 用于化學測序的PCR 產物的標記 699
15.2.6 備擇方案4 PCR 產物的基因組測序 700
15.3 用于基因組測序及足跡分析的連接介導PCR 701
15.3.1 基本方案連接介導的單側PCR 701
15.3.2 輔助方案1 從單層細胞制備用于DMS 足跡分析的基因組DNA 705
15.3.3 輔助方案2 從懸浮細胞中制備用于DMS 足跡分析的基因組DNA 708
15.3.4 輔助方案3 用于化學測序的基因組DNA 的制備 709
15.4 PCR 產物的分子克隆 711
15.4.1 基本方案產生T-A 凸出端 711
15.4.2 備擇方案產生半位點 713
15.5 PCR 擴增RNA （RT-PCR） 714
15.5.1 基本方案在最適條件下進行RNA 的PCR 擴增 714
15.5.2 備擇方案1 避免長時間的共沉淀及復性步驟的方法 716
15.5.3 備擇方案2 將cDNA 直接用于擴增步驟 716
15.5.4 輔助方案粗制RNA 的快速提取 717
15.6 利用單側PCR （錨式PCR） 進行cDNA 擴增 717
15.6.1 基本方案1 擴增己知序列的下游（3'端）區(qū)段 717
15.6.2 基本方案2 擴增己知序列上帶（ 5'端）區(qū)段 721
15.7 通過PCR 方法對微量DNA 進行定量分析 723
基本方案 723
第16章 蛋白質的表達 726
16.1 蛋白質在大腸桿菌中的表達概述 727
16.2 T7 噬菌體RNA 聚舍酶/啟動子表達系統(tǒng) 730
16.2.1 基本方案用雙質粒系統(tǒng)進行表達 730
16.2.2 備擇方案1 質粒編碼蛋白的選擇'性標記 732
16.2.3 備擇方案2 通過M13 噬菌體mGP1-2 感染的表達 733
16.3 融合蛋白載體表達概述 734
16.4 融合蛋白的酶解和化學裂解 736
16.4.1 基本方案1 用Xa 困子進行融合蛋白的酶解 736
16.4.2 輔助方案用b 因子進行變性融合蛋白的裂解 737
16.4.3 備擇方案1 用凝血酶進行融合蛋白的酶解 738
16.4.4 備擇方案2 與分離介質結合的GST 融合蛋白的酶解 738
16.4.5 備擇方案3 用腸激酶進行融合蛋白的酶解 739
16.4.6 基本方案2 用澳化氧對融合蛋白進行化學降解 740
16.4.7 備擇方案4 用提臟化學裂解融合蛋白 741
16.4.8 備擇方案5 低pH l水解融合蛋白進行化學裂解 741
16.5 谷臟甘膚-s-轉移酶融合蛋白的表達及純化 742
基本方案 谷脫甘肽-5-轉移酶融合蛋白的表達及純化 742
16.6 硫氧還蛋白融合蛋白的表達和純化 745
16.6.1 基本方案硫氧還蛋白融合蛋白的構建和表達 745
16.6.2 輔助方案1 用弗氏細胞壓碎器裂解大腸桿菌 748
16.6.3 輔助方案2 硫氧還蛋白融合蛋白的滲透性釋放 750
16.6.4 輔助方案3 用熱處理純化硫氧還蛋白 750
16.7 桿狀病毒表達系統(tǒng)的概述 751
桿狀病毒表達系統(tǒng) 751
昆蟲細胞中蛋白質的翻譯后修飾 753
用桿狀病毒表達系統(tǒng)超量表達蛋白質的步驟 753
選擇桿狀病毒轉移載體 753
16.8 昆蟲細胞培養(yǎng)的保存及重組桿狀病毒的產生 757
16.8.1 基本方案1 昆蟲細胞的保存和培養(yǎng) 757
16.8.2 基本方案2 用線性化桿狀病毒DNA 共轉染昆蟲細胞 759
16.8.3 備擇方案用野生型桿狀病毒DNA 共轉染產生重組病毒 761
16.8.4 基本方案3 桿狀病毒儲液的制備 764
16.8.5 基本方案4 用噬斑試驗測定病毒儲液的滴皮 765
16.9 用桿狀病毒系統(tǒng)表達和純化重組蛋白 767
16.9.1 基本方案1 用于最初分析的小規(guī)模表達 767
16.9.2 輔助方案1 蛋白質生產高峰期的確定 76 8
16.9.3 輔助方案2 重組蛋白的代謝標記
16.9.4 基本方案2 重組蛋白的大規(guī)模生產 770
16.9.5 基本方案3 含有多聚組氨酸標簽重組蛋白的純化 771
16.9.6 備擇方案含有GST 標簽重組蛋白的純化 772
16.10 概述：蛋白質在哺乳動物細胞中表達 773
16.10.1 病毒介導的基因轉移 774
16.10.2 瞬時表達
16.11 用cos 細胞瞬時表達蛋白質 778
基本方案 778
16.12 癥苗病毒表達系統(tǒng)概述 780
16.13 細胞系和癥苗病毒儲液的制備 783
16.13.1 基本方案1 貼壁細胞的培養(yǎng) 784
16.13.2 基本方案Z 懸浮細胞的培養(yǎng) 785
16.13.3 基本方案3 癥苗病毒儲液的制備 786
16.13.4 輔助方案1 噬斑分析測定癥苗病毒儲液的滴度 787
16.13.5 基本方案4 雞胚成纖維細胞的制備 788
16.13.6 基本方案5 MVA 病毒儲液的制備 789
16.13.7 輔助方案2 用免疫染色法滴定MVA 病毒 790
16.14 重組癥苗病毒的制備 792
16.14.1 基本方案1 癥苗載體轉染（瘟苗病毒）感染的細胞 792
16.14.2 輔助方案1 癥苗病毒的純化 796
16.14.3 輔助方案2 癥苗病毒DNA 的提取 798
16.14.4 基本方案2 篩選重組病毒噬斑 799
16.14.5 基本方案3 噬斑擴增 801
16.14.6 基本方案4 重組MVA 的活體免疫染色 803
16.14.7 輔助方案3 用刀豆蛋白A包被組織培養(yǎng)板 804
16.15 重組癥苗病毒及其產物的鑒定 804
16.15.1 基本方案1 應用PCR 方法檢測癥苗DNA 805
16.15.2 基本方案2 應用Southem 雜交檢測癥苗病毒DNA 807
16.15.3 基本方案3 應用斑點雜交檢測癥苗病毒DNA 808
16.15.4 備擇方案應用點印跡檢測表達的蛋自質 809
16.15.5 基本方案4 應用免疫印跡檢測表達蛋自 810
16.15.6 基本方案5 應用免疫沉淀栓測表達蛋白 811
16.16 用癥苗病毒/T7 RNA 聚合酶系統(tǒng)表達基因 812
16.16.1 基本方案1 重組癥菌病毒（vTF7-3） 感染后的脂質體轉染 813
16.16.2 基本方案2 兩種重組瘟苗病毒共感染細胞 815
16.16.3 基本方案3 單病毒感染OST7-1 細胞 816
16.16.4 基本方案4 利用VOTE 系統(tǒng)進行基因表達 817
16.16.5 輔助方案脈沖標記檢測表達的蛋白質 818
16.17 自主調節(jié)的四環(huán)素控制系統(tǒng)誘導基因表達 819
16.17.1 基本方案磷酸鈣介導的pTet-tTAK 穩(wěn)定轉染NIH3T3 細胞和四環(huán)素調控的靶質粒 820
16.17.2 輔助方案分析目的基因的蛋白質表達 823
16.18 從哺乳動物細胞中表達和純化抗原決定簇標記的多亞基蛋白復合體 825
16.18.1 基本方案1 從組成型表達FLAG 標記蛋白的克隆化細胞系中純化多亞基蛋白復合物 826
16.18.2 基本方案2 從條件性表達FLAG 標記蛋白的克隆化細胞系中純化多亞基蛋白復合體 829
16.18.3 備擇方案變化起始材料和挽脫條件純化抗原表位標記蛋自復合體的多種形式 831
16.18.4 輔助方案用P11 離子交換層析柱純化多種形式的抗原表位標記的蛋白復合體 834
第17章 蛋白質磷酸化的分析 836
17.1 蛋白質磷酸化概述 837
17.2 32 目標記培養(yǎng)細胞和制備用于免疫沉淀的細胞裂解物 838
17.2.1 基本方案培養(yǎng)細胞的32 Pi 標記和溫和去垢劑裂解法 838
17.2.2 備擇方案SDS 煮沸法裂解細胞 840
17.3 磷酸氨基酸分析 841
17.3.1 基本方案磷酸氨基酸的酸水解和雙向電旅分析 841
17.3.2 備擇方案堿處理提高轉移至濾膜上的含磷酸酶氨酸和磷酸蘇氨酸的蛋白質的檢測靈敏度 844
17.4 分析非標記蛋白質的磷酸化作用 845
17.4.1 基本方案1 用抗磷酸醋氨酸抗體和標記蛋白A 進行免疫印跡分析 845
17.4.2 備擇方案用增強化學發(fā)光法（ECL） 檢測結合的抗體 846
17.4.3 基本方案2 磷酸酶消化法鑒定磷酸化的蛋白質 847
17.5 酶法檢測磷酸化作用 848
17.5.1 基本方案1 用非特異酸性磷酸酶精化磷酸蛋白質 848
17.5.2 備擇方案1 用非特異堿性磷酸酶捕化磷酸蛋白質 849
17.5.3 基本方案2 用絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白質 850
17.5.4 備擇方案2 用酶氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白質 850
17.5.5 輔助方案離解32 P的測量和鑒定 851
17.6 特異性識別酷氨酸磷酸化膚的抗體的制備 851
17.6.1 基本方案1 抗磷酸膚的多克隆抗體的制備 851
17.6.2 基本方案2 抗磷酸膚的單克隆抗體的制備 854
17.6.3 輔助方案1 膚的合成 856
17.6.4 輔助方案2 將膚鏈交聯(lián)到AFFI-GEL 10 親和介質上 856
17.6.5 輔助方案3 將磷酸酶氨酸交聯(lián)到AFFI-GEL 10 親和介質上 858
17.7 用外源性底物分析蛋白激酶 859
17.7.1 基本方案1 環(huán)核苷酸依賴性蛋白激酶的分析 861
17.7.2 基本方案2 蛋白撒酶C 異構體的分析 862
17.7.3 基本方案3 用--酶蛋白進行酷蛋白撒酶的分析 863
17.7.4 備擇方案用多膚底物進行酷蛋白激酶的分析 863
17.7.5 基本方案4 Ca2+ I鈣調蛋白依賴性激酶的分析 864
17.7.6 基本方案5 醋氨酸撒酶的分析 865
17.7.7 基本方案6 在凝肢中直接進行激酶的分析 866
17.7.8 輔助方案1 用于激酶分析的細胞裂解方案 867
17.7.9 輔助方案2 三氯乙酸沉淀法測定放射性物質的摻入率 868
17.7.10 輔助方案3 P81 磷酸纖維素膜的吸附 868
17.8 研究蛋白質磷酸化的滲透策略 870
17.8.1 基本方案用滲透細胞進行蛋白磷酸化的分析 871
17.8.2 備擇方案1 用于SDS-PAGE 的天然細胞樣品制備 873
17.8.3 備擇方案2 制備用于等電聚焦的夭然細胞樣品 874
17.9 磷酸膚圖譜和磷酸化位點的鑒定 874
17.9.1 基本方案1 用SDS-聚丙烯酷股凝肢分離的蛋白質的膜蛋白酶磷酸膚圖譜 875
17.9.2 備擇方案固相化蛋白質的水解消化 881
17.9.3 輔助方案1 從纖維素平板上提取磷酸膚 882
17.9.4 基本方案2 用于工EDMAN 降解法測定膚中磷酸化氨基酸的位置 883
17.9.5 基本方案3 第二次鑒別性捎化以檢測磷酸膚中特定氨基酸的存在 885
17.9.6 輔助方案2 用于微序列測定或質譜的磷酸膚的制備 886
第18章 生物信息學 888
18.1 用BLAST 程序組進行序列相似性搜索 888
18.1.1 BLAST 概述 889
18.1.2 搜索策略 907
第四章蛋白質相互作用的分析 912
19.1 利用相互作用阱/雙雜交系統(tǒng)鑒定相互作用蛋白 915
19.1.1 基本方案1 鑒定誘餌蛋白 916
19.1.2 基本方案2 相互作用蛋白的捕獲 923
19.1.3 備擇方案1 相互作用阱的快速篩選 931
19.1.4 備擇方案2 通過相互作用交配進行捕獲實驗 932
19.1.5 輔助方案1 用于免疫印跡分析的蛋白質提取物的制備 934
19.1.6 輔助方案2 制備蛙精載體DNA
19.2 與GST 融合蛋白結合的蛋白質的親和純化 937
19.2.1 基本方案GST 融合蛋自的親和純化 937
19.2.2 輔助方案E.coli提取物的制備 937
19.3 基于噬菌體表達克隆來確認相互作用蛋白質 940
基本方案相互作用克隆 941
19.4 表面等離子共振技術 944
19.4.1 基本方案1 使用BIAcore 芯片的表面等離子共振 944
19.4.2 基本方案2 使用NTA-SAM 芯片的表面等離子共振 946
19.5 用共沉淀法檢測蛋白質一蛋白質之間的相互作用 946
19.5.1 基本方案用蛋白A/G-瓊脂糖共沉淀蛋白 946
19.5.2 備擇方案用GST 融合蛋白共沉淀 947
19.6 用Far Western 分析識別蛋白質相互作用 948
19.6.1 基本方案用Far Western 分析蛋白質混合物 949
19.6.2 備擇方案1 用免疫印跡技術檢測相互作用蛋白質 950
19.6.3 備擇方案2 在Far Western blot 中用多膚檢測特定的相互作用序列 951
第20章 染色質的裝配與分析 953
20.1 微球菌核酸酶分析染色質結構 954
20.1.1 基本方案1 滲透化細胞的染色質的徽球菌核酸酶消化 954
20.1.2 基本方案2 分離的細胞核的染色質的微球菌核酸酶消化 955
20.1.3 基本方案3 純化的基因組DNA 的微球菌核酸酶消化 957
20.1.4 輔助方案1 染色質消化得到的DNA 的純化和鑒定 957
20.1.5 輔助方案2 核酸酶切割圖譜分析策略 959
20.1.6 輔助方案3 使用改進的LM-PCR 方法在核苷酸水平上檢測MNase 對雙鏈的切割 961
20.2 分離Triton/乙酸/尿素聚丙烯酷膠凝膠電泳分離組蛋白變體和翻譯后修飾異構體 962
20.2.1 基本方案組蛋白的Tritonl乙酸/尿素聚丙烯酣睡凝肢電泳分析 963
20.2.2 輔助方案1 凝肢板的組裝 964
20.2.3 輔助方案2 從制備的核中分離組蛋白 965
20.2.4 輔助方案3 TAU-聚丙烯酣睡凝臟的電轉移 966
20.3 用免疫共沉淀的方法從總細胞抽提物中確定與染色質結合的蛋白質 967
基本方案用免疫共沉淀的方法從細胞總抽提物中確定與染色質結合的蛋白質 967
20.4 從哺乳動物細胞中分離組蛋白和核小體核心 967
20.4.1 基本方案1 精核的制備 967
20.4.2 基本方案2 去H1 的寡聚刷、體的溶解和純化 972
20.4.3 基本方案3 單聚及二聚核小體的純化 974
20.4.4 基本方案4 握磷灰石層析法純化核心組蛋白 975
20.5 用鹽透析的方法組裝核小體模板 975
20.5.1 基本方案1 用逐步鹽透析的方法組裝核小體模板 976
20.5.2 基本方案2 用梯度鹽透析的方法組裝高濃度的單核小體 977
20.5.3 基本方案3 用梯庭鹽透析的方法組裝核小體串 978
20.5.4 輔助方案1 細菌的重組核心組蛋白的純化 979
20.5.5 輔助方案2 用于單核小體組裝的單鏈5'端標記的DNA 的制備 980
20.5.6 輔助方案3 用于組裝高濃度非標記的單核小體的DNA 的制備 981
20.5.7 輔助方案4 用于核小體串組裝的DNA 的制備 982
20.5.8 輔助方案5 用瓊脂糖凝肢電掠分析重建復合體 982
20.5.9 輔助方案6 用聚丙烯釀臘凝肢電泳分析重建復合體 983
20.5.10 輔助方案7 通過EcoRI 消化確定G5E4核小體串組裝的革圍 983
20.6 使用果蠅系統(tǒng)進行染色質重組 984
20.6.1 基本方案1 果蠅5-190 染色質重組抽提物的制備 984
20.6.2 基本方案2 從果蠅胚胎中純化核心組蛋白 984
20.6.3 基本方案3 用5-190 抽提物進行染色質重組 988
20.6.4 基本方案4 重組的果蠅ACF 的表達和純化 990
20.6.5 基本方案5 重組的果蠅NAP-l 的表達和純化 991
20.6.6 備擇方案1 重組的果蠅NAP-l 的表達和純化（NTA Surperflow 樹脂） 993
20.6.7 基本方案6 使用重組的果蠅因子進行染色質裝配 993
20.6.8 備擇方案2 重組染色質裝配反應中的核心組蛋白與DNA 比率的滴定 995
20.6.9 輔助方案果蠅拓撲異構酶I 的核心催化區(qū)域的表達和純化 996
第21章 核酸陣列 998
21.1 核酸陣列概述 998
21.1.1 微陣列擅長做什么？ 998
21.1.2 核酸陣列還能夠做什么？ 1000
21.1.3 關于數(shù)據(jù)分析 1001
21.1.4 哪里有更多的信息？ 1002
21.2 用于表達分析的mRNA 的制備 1003
21.2.1 策略安排 1003
21.2.2 基本方案用于表達監(jiān)測以及與寡核苦酸芯片雜交的mRNA 擴增 1004
21.2.3 輔助方案1 對照基因的體外轉錄和轉錄庫的制備 1008
21.2.4 備擇方案cDNA 和體外轉錄產物的回相可逆固定（SPRI）純化 1010
21.2.5 輔助方案2 cDNA 定量 1011
21.3 用cDNA 陣列技術檢測人的基因表達譜 1012
21.3.1 基本方案1 cDNA 擴增和影印 1012
21.3.2 基本方案2 RNA 抽提和標記 1016
21.3.3 基本方案3 雜交和數(shù)據(jù)處理 1019
21.3.4 輔助方案1 EST 的瓊脂糖凝肢電泳 1021
21.3.5 輔助方案2 熒光法測定DNA 濃度 1023
21.3.6 輔助方案3 多聚賴氨酸封閉玻片 1023
第22章 組合文庫的建立和使用 1025
22.1 構建組合庫及文庫所用的DNA 庫的設計、合成和擴增 1025
22.1.1 基本方案1 隨機序列庫的純化 1025
22.1.2 輔助方案1 庫的復雜度的測定 1026
22.1.3 輔助方案2 庫的偏好性的測定 1028
22.1.4 輔助方案3 庫擴增的小規(guī)模PCR 反應的優(yōu)化 1028
22.1.5 基本方案2 庫DNA 的大規(guī)模擴增 1029
22.2 膚適配體z 用于細胞過程的正向及反向分析的顯性遺傳學試劑 1031
22.2.1 基本方案1 構建硫氧還蛋白膚適配體組合庫 1031
22.2.2 基本方案2 利用雙雜交系統(tǒng)相互作用阱/篩選特定蛋白的膚適配體 1033
22.2.3 基本方案3 通過相互作用交配確定識別特異性 1035
22.2.4 基本方案4 膚適配體的親和力成熟 1036
22.2.5 基本方案5 用膚適配體正向分析細胞過程 1038
22.2.6 輔助方案膚適配體靶點的鑒定 1039
22.3 利用mRNA 顯示法進行蛋白篩選 1040
22.3.1 基本方案1 制備和純化mRNA 顯示蛋白 1040
22.3.2 基本方案2 mRNA 顯示蛋白的純化和逆轉錄 1044
22.3.3 基本方案3 RNA 顯示蛋白的篩選與擴增 1046
22.3.4 輔助方案1 FLAG 標簽的純化 1050
22.3.5 輔助方案2 誘導突變PCR 1050
第23章 單個細胞或-群細胞間差異表達基因的發(fā)現(xiàn)和分析 1052
23.1 差減cDNA 文庫的建立 1052
基本方案差減cDNA 文庫的構建 1052
23.2 基于PCR 的差減cDNA 克隆 1056
23.2.1 基本方案差躪cDNA 文庫的構建 1056
23.2.2 輔助方案狹鍾斑點雜交監(jiān)測差減過程 1062
23.3 mRNA 的PCR 差異顯示 1064
基本方案mRNA 的PCR 差異顯示 1064
23.4 限制性內切核酸酶介導的差異顯示（RMDD） 1067
23.4.1 基本方案RMDD 文庫的準備和兩輪擴增 1068
23.4.2 備擇方案兩階段PCR 擴增 1073
23.4.3 輔助方案直接印跡電泳 1074
23.5 基于AFLP 的轉錄表達譜分析 1077
基本方案基于AFLP 的轉錄表達譜分析 1077
23.6 基因表達系列分析（SAGE） 1083
23.6.1 基本方案基因表達系列分析（SAGE） 1083
23.6.2 輔助方案1 PCR 驗證cDNA 產物 1094
23.6.3 輔助方案2 優(yōu)化雙標簽的PCR 擴增 1095
附錄1 試劑和溶渡 1097
附錄2 實用測量值和數(shù)據(jù) 1247
附錄3 生物化學和分子生物學常用技術 1264
附錄3A 凝膠和印跡實驗中放射性標記蛋白和DNA 的檢測及定量 1264
附錄3B 玻璃器皿的硅化 1271
附錄3C 透析與超濾 1271
附錄3D 用吸收光譜法和熒光光譜法定量DNA 和RNA 1277
附錄3E 通過沉默突變引人限制性內切核酸酶識別位點 1280
附錄3F 哺乳動物細胞組織培養(yǎng)技術 1282
附錄3G 安全使用放射性同位素 1290
附錄3H 分子生物學家的統(tǒng)計學：組比較 1300
附錄4 試劑和設備的供應商 1323
附錄5 參考文獻 1368
索引 1385