實驗前該準備哪些試劑？怎么配制實驗試劑？實驗前該準備哪些儀器？怎么培養(yǎng)海馬神經(jīng)元？怎么觀察神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)？怎么鑒定神經(jīng)元？怎么培養(yǎng)小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元？怎么培養(yǎng)神經(jīng)干細胞？怎么培養(yǎng)原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞？怎么測定小膠質(zhì)細胞趨化、遷移、吞噬功能？怎么測試實驗動物的學(xué)習(xí)和記憶？怎么檢測基因芯片？怎么做神經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色？怎么應(yīng)用Image J 神經(jīng)生物分析軟件、GraphPad Prism 6.0軟件、SPSS軟件？……本書圖文結(jié)合予一一介紹。實驗流程嚴格按照美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）、國立老化研究所（NIA）的標準、規(guī)范執(zhí)行。內(nèi)容實用，具有可操作性。
本書適合從事神經(jīng)病學(xué)研究的人員，如神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科醫(yī)師、研究生、醫(yī)學(xué)院�；A(chǔ)研究人員，特別適合初學(xué)者閱讀參考。
實驗流程嚴格按照美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）、國立老化研究所（NIA）的標準、規(guī)范執(zhí)行,包括實驗技術(shù)的概述，材料準備、操作步驟、操作指導(dǎo)、思考、注意事項（包括實驗結(jié)果不是想要的時的應(yīng)急預(yù)案）、失敗的經(jīng)驗或成功的經(jīng)驗總結(jié)等,圖文結(jié)合介紹Image J 神經(jīng)生物分析軟件、GraphPad Prism 6.0軟件、SPSS軟件的應(yīng)用按本書的指導(dǎo)，可以提高實驗效率，分析統(tǒng)計實驗結(jié)果。
神經(jīng)變性疾�。∟eurodegenerative Diseases）是一類由于腦和（或）脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能漸進性退變、缺失所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等。隨著全球社會人口老齡化進程加速，神經(jīng)變性疾病患病人數(shù)逐年上升，已不再是少見病。神經(jīng)變性疾病的早期診斷與識別困難，目前尚無有效的根治手段，加強其病因和發(fā)病機制研究成為國際神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點。除了年齡老化外，遺傳和環(huán)境因素也是本類疾病的主要致病因素。神經(jīng)變性疾病以運動功能和認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，組織病理學(xué)顯示特定部位神經(jīng)元緩慢漸進性丟失，并大多在神經(jīng)細胞內(nèi)出現(xiàn)蛋白質(zhì)異常聚集、形成包涵體。此類疾病可能具有相似的發(fā)病機制，包括：蛋白的錯誤折疊；細胞器中蛋白降解紊亂，線粒體功能障礙，軸突轉(zhuǎn)運異常；細胞程序性死亡（凋亡、自噬）；線粒體DNA突變和氧化應(yīng)激等。
2013年我得到醫(yī)院公派出國留學(xué)的機會，有幸來到世界著名的美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）、美國國家衰老研究所（NIA）進修學(xué)習(xí)。這里有二十幾個研究機構(gòu)，匯集了全世界的科學(xué)精英從事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。之前我雖是個神經(jīng)內(nèi)科大夫，但始終無法忘卻在攻讀碩士、博士研究生期間從事神經(jīng)科學(xué)實驗過程所經(jīng)歷的痛楚和樂趣。原以為自己掌握了許多神經(jīng)生物學(xué)的基本實驗技能，但來到NIH之后才知道國內(nèi)與這邊的差距。NIH的神經(jīng)科學(xué)家們做實驗的規(guī)范程度和完成實驗的效率讓我驚嘆不已！我認為這些很大一部分歸功于規(guī)范的實驗操作流程和有序的分工協(xié)作。有感而發(fā)，心中萌動編寫一部規(guī)范、實用的神經(jīng)變性疾病相關(guān)的實驗技術(shù)操作和方法的手冊。于是乎，盡我所能，盡力在NIH把標準規(guī)范的實驗流程一一學(xué)到，每項親自操作，并由此將所學(xué)實驗經(jīng)歷和經(jīng)驗融匯記載于書中，一來作為督促自己學(xué)習(xí)的動力，二來將其中的經(jīng)驗與其他學(xué)者分享。但更為重要的是，本書的編寫旨在幫助國內(nèi)從事或感興趣神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員（尤其是初學(xué)者）在實驗操作方面盡可能少走些彎路，提高一些實驗效率，多一點時間去觀察和發(fā)現(xiàn)真實的、新的實驗現(xiàn)象，多一些時間去思考實驗設(shè)計、訓(xùn)練自己的科研思維，并碰撞出更多、更富有創(chuàng)新意義的思想火花。
同時，本書編寫包含了神經(jīng)變性疾病臨床數(shù)據(jù)登記體例和數(shù)據(jù)庫建設(shè)要點，并介紹了本單位團隊自主研發(fā)的神經(jīng)心理認知測試系統(tǒng)及其應(yīng)用，以及我們在臨床和基礎(chǔ)科研過程中十分常用的圖像和數(shù)據(jù)處理軟件，如Image J、GraphPad Prism、SPSS的應(yīng)用范式、Endnote文獻編輯等。相信，無論是從事神經(jīng)病學(xué)的臨床還是基礎(chǔ)科研人員都能從本書中獲得許多十分有用的幫助。
本書的編寫過程得到福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院陳曉春教授、黃品華教授提出的寶貴意見。同時由衷感謝美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）、美國國立老化研究院（NIA）蔡懷彬高級研究員及其所在實驗室成員在我在NIH學(xué)習(xí)期間對我實驗技術(shù)的悉心傳授，以及感謝他們在編寫本書過程中提供的寶貴意見。
本書由國家自然科學(xué)基金（項目號：81200991及81571257）、福建省高校新世紀人才支持計劃（項目號：JA13131）、福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目資助計劃重點項目(項目號：2014-ZQN-ZD-11)、福建省自然科學(xué)基金（面上聯(lián)合）（項目號：2015J01398）以及國家臨床重點專科老年病科建設(shè)項目、福建省臨床重點�？评夏赆t(yī)學(xué)科建設(shè)項目聯(lián)合資助出版。
潘曉東
福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
福建省老年醫(yī)學(xué)研究所
福建省分子神經(jīng)病學(xué)重點實驗室
2016年6月22日于福州
潘曉東，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師。福建省醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會秘書及青年委員，第九屆中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師大會華南分會秘書。長期從事神經(jīng)病學(xué)的臨床、教學(xué)、科研工作。曾赴美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）/國立老化研究所（NIA）研修1年。專業(yè)特長：阿爾茨海默病、帕金森病等老年神經(jīng)變性疾病的診治，尤其對各種癡呆性疾病的鑒別診斷及治療具有豐富的臨床經(jīng)驗。近年承擔(dān)多項國家層面及省級科研課題，發(fā)表SCI源及核心期刊論文10余篇，主編專著1部。曾獲“福建青年科技獎”及“福建運盛青年科技獎”榮譽。
第一章 原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)和細胞功能測定 / 1
第一節(jié) 原代皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 1
第二節(jié) 新生小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng) 3
一、單層皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元 3
二、單層星形膠質(zhì)細胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元及形成
神經(jīng)突觸 9
三、本節(jié)實驗中使用到的試劑和溶液 11
四、注意事項 13
五、常見問題及解決方案 13
六、預(yù)期結(jié)果 13
七、時間因素 14
第三節(jié) 小鼠神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 14
一、成年鼠神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 14
二、新生鼠海馬神經(jīng)干細胞的培養(yǎng) 19
三、胎鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng) 20
第四節(jié) 原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 21
一、星形膠質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng) 21
二、新生鼠小膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng) 23
三、成年鼠小膠質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng) 25
第五節(jié) 小膠質(zhì)細胞功能實驗 29
一、趨化和遷移實驗 29
二、體外測定小膠質(zhì)細胞吞噬功能（吞噬尼羅紅微球/a突觸核蛋白/Ab） 30
第二章 模式動物行為學(xué)實驗 / 34
第一節(jié) Morris水迷宮 34
第二節(jié) Y-迷宮 36
第三節(jié) 小鼠平衡功能實驗 39
第四節(jié) 抑郁模型的建立和評定 40
一、抑郁癥的模型制作 41
二、抑郁動物的行為學(xué)評價 45
第五節(jié) 嗅覺行為功能測定 47
一、埋藏食物小球?qū)嶒?48
二、嗅覺迷宮 48
第六節(jié) 大腦中動脈閉塞模型的建立和評定 49
第七節(jié) 運動功能評定 52
一、小鼠肢體力量測試實驗——小鼠抓力測試 52
二、小鼠耐力測試實驗——跑臺實驗 53
第八節(jié) 感覺（痛觸覺）系統(tǒng)評估 54
一、Von Frey Test 54
二、智能熱板儀 56
三、甩尾實驗 57
第三章 神經(jīng)病理學(xué)實驗 / 59
第一節(jié) 腦組織的取材、保存和標本制作 59
第二節(jié) 脊髓組織的取材、保存和標本制作 62
一、脊髓的取材和保存 62
二、 脊髓冰凍切片的制作 64
第三節(jié) 小鼠腦脊液采集 66
第四節(jié) 海馬腦片場電位的神經(jīng)電生理記錄方法 67
第五節(jié) 神經(jīng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色 71
第六節(jié) 透視電鏡標本制作 74
第七節(jié) 老化組織相關(guān)病理特殊染色（SA-b-gal 、銀染色） 77
一、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）染色 77
二、b-淀粉樣蛋白染色 80
三、衰老相關(guān)b-半乳糖苷酶染色 82
第八節(jié) 神經(jīng)組織高爾基染色 83
第九節(jié) 神經(jīng)組織體視學(xué)分析技術(shù) 86
第十節(jié) 共聚焦掃描及定量技術(shù) 92
一、激光共聚焦顯微鏡的成像原理 92
二、激光共聚焦顯微鏡在神經(jīng)變性疾病研究中的運用 93
三、激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu) 95
四、基本掃描及圖像獲取 95
五、微分干涉差（DIC）掃描及圖像獲取 102
六、拼圖掃描及圖像獲取 103
七、Z-Stack掃描及圖像獲取 103
八、時間序列掃描 105
九、激光共聚焦圖像定量及后處理 106
第四章 神經(jīng)生化和基因檢測 / 115
第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物的基因型鑒定、保種和管理 115
一、小鼠生殖生理 115
二、小鼠的生長周期 116
三、基因工程鼠飼養(yǎng)繁殖一般流程和注意事項 116
四、常用小鼠品系的概況 117
五、幾種常用神經(jīng)變性疾病轉(zhuǎn)基因鼠的介紹和鑒定 118
第二節(jié) 神經(jīng)組織蛋白檢測 125
一、蛋白質(zhì)印跡法 125
二、免疫共沉淀原理及步驟 130
三、動物腦組織勻漿檢測Ab 132
第三節(jié) RNA提取及實時熒光定量PCR技術(shù) 134
一、RNA提取 134
二、RT-PCR 135
三、qPCR 135
第四節(jié) 基因芯片檢測 140
一、單核苷酸多態(tài)性芯片實驗 140
二、基因表達譜芯片檢測 142
第五節(jié) 熒光素酶報告基因技術(shù)分析啟動子轉(zhuǎn)錄活性 143
第六節(jié) 熒光定量PCR法檢測端粒酶活性 146
第七節(jié) 中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸和非突觸線粒體的分離提取 148
第五章 分子影像技術(shù)檢測神經(jīng)變性疾病 / 157
第一節(jié) PET/SPECT-CT顯像探針的制備 158
第二節(jié) fMRI成像技術(shù)的原理及其實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理 164
一、fMRI實驗設(shè)計 164
二、實驗設(shè)備 166
三、實驗數(shù)據(jù)處理 166
四、fMRI實驗相關(guān)的準備 169
五、小結(jié) 170
第六章 神經(jīng)變性疾病患者臨床神經(jīng)評估、樣本保存和數(shù)據(jù)庫建設(shè) / 171
第一節(jié) 神經(jīng)變性疾病臨床登記和數(shù)據(jù)庫建立和實施 171
一、臨床研究目標的確立 171
二、研究方案的確立 172
三、組織機構(gòu)的建立 173
四、病例報告表（CRF）的建立 174
第二節(jié) 神經(jīng)變性疾病患者血液、腦脊液組織樣本的保存和處理 177
一、血液及血液成分的處理和保存 178
二、腦脊液的處理和保存 179
三、標本DNA的提取和保存 180
附表6-1 標本保存詳細記錄 180
附表6-2 關(guān)于使用組織樣本開展科學(xué)研究的知情同意書 181
第三節(jié) 神經(jīng)心理認知障礙測試診斷系統(tǒng) 182
一、醫(yī)生端系統(tǒng) 182
二、用戶管理 183
三、臨床病例登記 183
四、案例管理 186
五、統(tǒng)計打印 190
六、量表管理 191
第七章 神經(jīng)生物學(xué)常用分析及作圖軟件的應(yīng)用 / 193
第一節(jié) Image J神經(jīng)生物分析軟件的應(yīng)用 193
一、 Image J神經(jīng)生物分析軟件的基本功能 193
二、 Image J神經(jīng)生物分析軟件分析免疫熒光定量技術(shù) 197
第二節(jié) Graphpad Prism 6.0作圖和統(tǒng)計應(yīng)用 205
一、折線圖 205
二、直條圖 208
三、生存曲線圖 216
四、散點圖 219
五、餅圖 225
第三節(jié) Logistic回歸、Cox風(fēng)險模型以及Kaplan-Meier曲線的統(tǒng)計應(yīng)用 231
一、Logistic回歸分析和ROC工作曲線的制訂 231
二、 Cox回歸分析 238
三、Kaplan-Meier曲線分析 242
第四節(jié) EndNote×7的應(yīng)用 245
一、文獻管理 245
二、論文撰寫 245
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